白细胞介素1α对人永生化角质形成细胞、水通道蛋白3表达的调节

闫学文，单士军

（1.天津市中医药研究院附属医院，天津300120；2.天津医科大学总医院，天津 300154）

中波紫外线（ultraviolet B,UVB）照射后，角质形成细胞（keratinocyte cell,KC）产生多种细胞因子，其中白细胞介素 1α（interleukin-1α,IL-1α）与皮肤光老化的作用极为密切。作为一种前炎症介质，IL-1α在UVB急性损伤后直接或间接影响皮肤中的免疫细胞及周围细胞，在免疫调节、炎症发生以及促进组织增生方面起了重要作用[1]。研究表明，水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP3）表达于正常皮肤的基底细胞细胞膜，是水和甘油的转运通道。在皮肤炎症、应激或某些慢性疾病以及肿瘤等情况下，AQP3表达发生变化[2]。但IL-1α和AQP3之间的关系尚未见报道。本研究以体外培养的人永生化角质形成细胞（HaCaT）为靶细胞，观察IL-1α处理后HaCaT细胞AQP3 mRNA和蛋白表达的变化。初步探讨其作用机理和临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 HaCaT由德国柏林自由大学本杰明·富兰克林医学中心惠赠。

1.1.2 主要试剂细胞培养液和胎牛血清购自美国Hyclone公司。抗人AQP3多克隆抗体由万寅生教授惠赠。Trizol RNA提取试剂为Invitrogen公司产品。总RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、RealMasterMix新型荧光定量PCR试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。引物由北京赛百盛公司合成。重组人IL-1α购自美国CaliforniaBioscience公司。

1.1.3 引物设计自行设计引物。内参GAPDH，上游引物:5′-TCC TGT GGC ATC CAC GAA ACT-3′；下游引物，5′-GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT-3′；扩增产物313 bp。AQP3，上游引物：5′-GCT GTC ACT CTG GGC ATC CTC-3′；下游引物：5′-GCG TCT GTG CCA GGG TGT AG-3′；扩增产物 133bp。

1.2 主要仪器设备 细胞培养超净台（蚌埠净化设备厂）、CO2培养箱（Queue SystemsTM2711美国）、倒置相差显微镜（OLYMPUS，I×70日本）、全能型高性能台式冷冻离心机（Heaeus,Biofuge Stratos德国）、深低温冰箱（SANYO，Altra Low日本）、蒸汽高压消毒箱（Tuttnauer,2540 MK美国）、550型酶标仪（Bio-Rad Laboratories Inc,Hercules加拿大）、实时定量荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）仪（Rotor-gene 3000,澳大利亚）、Waldmann窄波UVB治疗仪（Waldmann，UV801KL德国）。

2 实验步骤

2.1 细胞培养 HaCaT细胞生长于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM培养液中，置于5%CO2、37℃孵箱中传代培养。

2.2 L-1α处理 待HaCaT细胞生长至约80%融合，弃培养基，PBS冲洗，加入不含血清的DMEM培养基，加IL-1α继续培养。

2.3 实验分组 1)阴性对照组:培养液对照；2）加入 IL-1α 1、10、100 μg/L，培养 24 h 后检测信使核糖核酸（massenger ribose nucleic acid,mRNA）及蛋白的变化；加入 IL-1α 10 μg/L，分别培养 6、12、24 h后检测mRNA及蛋白的变化。收集的培养上清或细胞保存于-80℃深低温冰箱或直接实验。每组实验重复3次。

2.4 实时荧光定量反转录酶-聚合酶全连锁反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RTPCR）检测AQP3 mRNA表达

2.4.1 总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA （1）收集HaCaT细胞，向每管约5×106个细胞中加入0.5 mL Trizol总RNA提取试剂，轻轻吹打，将均浆样本放于室温5 min，使核酸蛋白复合物完全分解。（2）加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置10min。（3）4℃，12000转/min离心15 min。（4）小心将上层无色水相移至新的Eppendorf管中。（5）缓慢加入1倍体积70%乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入试剂盒提供的吸附柱中。（6）4℃下以12 000×g的速度离心10 min，离心后在管的底部及管壁可以看到凝胶状RNA小滴。弃去收集管中的废液，加入1 mL 75%乙醇洗RNA小滴1次，涡旋混合样本。（7）4℃下以7 500×g的速度离心5 min，室温下空气干燥5～10 min。（8） 用 0.1 mL焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate,DEPC）水溶解RNA，55～60℃孵育10min。（9）取10μLRNA溶液，加990μLDEPC水稀释，在紫外分光光度计内测定RNA溶液在260nm及280nm处的光密度（A）值。A 260/A 280>1.7时标本可用，否则重新提取。根据A 260值计算RNA浓度。

2.4.2 逆转录 （1）在冰浴的无核酸酶的离心管中加入 2 μg总 RNA，2 μL Random，2 μL dNTP，补RNase-free水定容至 13.5 μL。（2）70℃加热 5 min后迅速在冰上冷却2 min，瞬时离心收集反应液后加入 4 μL 5 × first-strand buffer,1 μL 0.1MDTT，0.5 μL RNasin。（3） 加 1 μL TIANScript M-MLV 混匀。25℃温浴10 min，42℃温浴50 min，95℃加热5 min终止反应，RNase-free ddH2O将体系稀释至30 μL，-20℃冻存备用。

2.4.3 PCR 反应 （1）20×SYBR solution室温平衡并彻底混匀。（2）将 125 μL 20×SYBR solution 加入至1 mL 2.5×RealMasterMix中。（3）在平头PCR管中分别加入 2.5×RealMasterMix/20×SYRB solution 9 μL，正向引物及负向引物各2 μL，逆转录产物 2 μL，超纯水 5 μL。反应体系为 20 μL。（4）在 RG3000 定量PCR仪上按照RealMasterMix新型荧光定量PCR试剂盒说明书进行PCR反应：95℃起始变性2 min，94℃变性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸30 s。用双标准曲线法对AQP3基因进行相对定量测定。实验结果重复3次。

2.5 western blot分析

2.5.1 收集细胞 胰蛋白酶消化各组培养的HaCaT细胞，离心后收集。

2.5.2 总蛋白的提取 在盛有收集好细胞的Eppendorf管中加入500 μL蛋白裂解液（50 mm Tris-HclpH7.4，150mmNacl，0.l%SDS,1%Triton-100；1mmEDTA pH8.0），冰浴下超声粉碎。4℃12000转/m，离心30 min。

2.5.3 样品蛋白浓度的定量样本取25 μL+2.5 mL碱性铜液室温静置20 min，加入0.25 mL酚试剂室温静置30 min。空白管样品以25 μL BD H2O代替。722s分光光度计测光密度值，计算蛋白浓度。

2.5.4 浓度的调整与样品的处理把样品调成相同浓度，浓度高的用蒸馏水补充，然后加入buffer，Eppendorf管用沸水煮5 min（使蛋白变性）。

2.5.5 电泳、转膜、杂交、染色:取20 μL细胞裂解液进行不连续10%十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳，90V恒定电压使溴酚蓝染料从4%浓缩胶进入8%分离胶后，以120 V恒定电压电泳至适当位置，4℃条件下用半干式电转仪将蛋白转印至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉封闭非特异性蛋白，室温，过夜。封闭好的膜用缓冲液TTBS（0.5 mL Tween-20加到1 000 mL TBS中。TBS组成：4.84 Tris，58.48 Nacl，溶于去离子水中，用 Hcl调PH至7.5）冲洗2次，每次5 min，按说明书要求的浓度加入待检测的一抗，室温2 h。TTBS冲洗2次，每次5 min。加碱性磷酸酶标记的相应二抗，室温孵育2 h。TTBS冲洗2次，每次5 min，TBS冲洗1次，5 min，加入碱性磷酶显色液显色，10～30 min后看结果。结果采用FluorChem 2.0分析软件扫描定量。

3 统计学处理

相应数据用SPSS 12.0统计包进行分析，两样本均数比较用t检验，多样本均数比较用方差分析，以P＜0.05有统计学意义。

3.1 IL-1α 1、10、100 μg/L 处理后 HaCaT 细胞AQP3 mRNA表达的变化分析实时定量PCR结果，以阴性组为基准，预设其AQP3 mRNA表达水平为1.0，采用单因素4水平设计定量资料的方差分析，显示四组之间总体来说差别有统计学意义（P<0.0001）。组间比较采用snk检验，各组之间差异均有统计学意义，见表1。

3.2 western blot分析结果 western blot结果显示，IL-1α 1、10、100 μg/L 处理后，HaCaT 细胞 AQP3 蛋白表达下降，以100 μg/L组下降最为明显。10 μg/L处理6 h下降最为明显，至12 h表达逐渐回复，见图 1，2。

表 1 IL-1α 1、10、100 μg/L 对 HaCaT 细胞AQP3 mRNA表达的影响

4 讨论

AQP3是的水和甘油透膜转运的通道蛋白，仅表达于正常皮肤基底细胞细胞膜上[3]。在某些生理或病理情况下，AQP3表达发生变化。有研究表明，当体外培养的HaCaT细胞处于高渗状态时，AQP3 mRNA表达上调，尤其是当处于山梨醇的高渗环境中[4]，但其机制未明。在特应性皮炎急性期或慢性期，AQP3 mRNA表达上调，并且表达位置亦较正常的基底细胞层上升，棘细胞层也表达AQP3。这和特应性皮炎患者透皮失水，皮肤干燥有密切的联系[3]。但AQP3在特应性皮炎过表达的机制尚不明确。另有研究报道，当机体处于炎症状态下，前炎症介质TNF-α也可以促进AQP3过表达，同时表达部位发生变化[2]。由此可见，目前对AQP3在体内体外各种生理、病理情况下发生的表达变化机制并不明确。我们的实验结果表明，IL-1α作用于体外培养的HaCaT细胞，在mRNA和蛋白水平均有明显的抑制作用，并具有剂量/时间-效应关系，这一变化发生的机制尚需要进一步的探讨。

UVB照射后可以增加HaCaT细胞IL-1α的分泌，而IL-1α又可以抑制HaCaT细胞AQP3的表达[5]。同时我们也观测到UVB照射后HaCaT细胞AQP3表达的抑制。因此我们不能确定是UVB照射后直接通过信号传导机制诱导了AQP3表达的抑制，还是通过IL-1α间接抑制了AQP3表达的表达，值得我们进一步研究。

［1］Hara-Chikuma M,Verkman AS.Aquaporin-3 facilitates epidermal cell migration and proliferation during wound healing[J].J Mol Med(Berl),2008,86:221-231.

［2］Tancharoen S,Matsuyama T,Abeyama K,et al.The role of water channel aquaporin 3 in the mechanism of TNF-alpha-mediated proinflammatory events:Implication in periodontal inflammation[J].J Cell Physiol,2008,217:338-349.

［3］Sugiyama Y,Ota Y,Hara M,et al.Osmotic stress up-regulates aquaporin-3 gene expression in cultured human keratinocytes[J].Biochim Biophys Acta,2001,1 522:82-88.

［4］Olsson M,Broberg A,Jernas M,et al.Increased expression of aquaporin 3 in atopic eczema[J].Allergy,2006,61:1 132-1 137.

［5］Ho JN,Lee YH,Lee YD,et al.Inhibitory effect of Aucubin isolated from Eucommia ulmoides against UVB-induced matrix metallopro teinase-1 production in human skin fibroblasts[J].Biosci Biotechnol Biochem,2005,69:2 227-2 231.