二苯乙烯苷对人脐静脉内皮细胞一氧化氮合酶及其基因的调节作用

沈建芬，张又枝，肖军花，王嘉陵

(1.浙江省嘉兴市第一医院，314000;2.华中科技大学同济医学院基础医学院药理系，武汉430030)

二苯乙烯苷(2，3，5，4＇-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG)是从何首乌中提取的活性成分，与人工合成的雌激素己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)及从法国红葡萄酒中提取的白藜芦醇(resveratrol，RES)具有相同的多羟基二苯乙烯结构。实验证实，DES和RES均可通过上调内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的mRNA和蛋白的表达水平，增加一氧化氮(nitricoxide，NO)产量，产生舒张血管的作用[1-2]。笔者前期实验发现，THSG具有舒张血管作用，且与增加血管NO产量有关[3-4]。因此推测

THSG增加NO产量产生舒张血管的作用可能与影响eNOS基因表达水平有关。笔者在本实验中研究THSG对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)NO含量及eNOS活性的影响及其作用机制，以期从基因水平阐述THSG增加NO产量、舒张血管的作用机制，为THSG的开发利用提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料THSG(华中科技大学同济医学院药理系王嘉陵教授提供)，HUVECs(华中科技大学同济医学院细胞库提供)，胰酶(购自Sigma公司，批号:9002077)，NO试剂盒(硝酸还原酶法)及NOS分型试剂盒购于南京建成生物工程有限公司。达尔伯克改良必需基本培养基(Dulbecco＇s modified minimal essential mediun，DMEM)及胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购于Gibco公司。RT-PCR试剂盒为TaKaRa公司。eNOS及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物合成为北京奥科公司。eNOS多克隆抗体及actin一抗购自Chemclo公司。

1.2 细胞培养及分组HUVECs用含10%FBS的DMEM培养液培养，3～4 d传代1次，取处于对数生长期细胞进行实验。实验组加入1，10，100 μmol·L－1THSG(用DMEM配制，过滤除菌)，对照组不加其他试剂，均用含2%FBS的DMEM培养液在二氧化碳(CO2)培养箱培养。每个实验组和对照组重复3次，取平均值。

1.3 HUVECs细胞上清液NO含量及eNOS活性的测定操作步骤严格按试剂盒操作说明书进行，721分光光度仪检测吸光度(A)值。

1.4 RT-PCR检测HUVECs eNOS mRNA表达水平总RNA抽提按照总RNA抽提试剂盒说明操作，A260/A280为1.8～2.0，取总RNA 1 μg，按照一步法RT-PCR试剂盒说明操作。eNOS引物序列正义:5＇-TCCTGTATGGCTCCGAGACC-3＇，反义:5＇-AGCAGGAGATGCTGTTGAAGC-3＇，扩增产物291 bp。GAPDH引物序列正义:5＇-GTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3＇，反义:5＇-CACGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3＇，扩增产物555 bp。RT-PCR条件:50℃30 min逆转录，94℃5 min预变性，然后94℃40 s变性，57℃40 s退火，72℃30 s延伸，共30个循环，最后72℃延伸7 min。RT-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后进行密度扫描，以eNOS/GAPDH灰度值计算待测基因相对表达量。

1.5 Western Blot检测HUVECs eNOS蛋白表达HUVECs蛋白提取液经考马斯亮蓝法调整至相同浓度，以50 μg·L－1上样，8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至硝酸纤维膜上。电转后的硝酸纤维膜用含5%脱脂奶粉封闭液封闭，此后分别加入eNOS兔抗一抗(1∶500稀释)，4℃孵育过夜，TTBS漂洗，加入二抗(1∶1 000稀释)孵育，再以PBST液振荡洗涤(15 min×3次)，化学发光法显色，凝胶定量软件Quantity One 4.52分析，以actin作内参照。

1.6 统计学方法实验数据用均数±标准差(±s)表示，采用t检验统计处理，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 THSG对HUVECs NO含量及eNOS活性的影响 各浓度THSG均使NO含量增加，使eNOS活性增强(P＜0.05或P＜0.01)，且随着浓度增加，作用增强，具有浓度依赖性，见表1。

表1 4组HUVECs NO含量与eNOS活性测定结果Tab.1 Results of the content of NO and eNOS activity in 4 groups of HUVECs ±s

表1 4组HUVECs NO含量与eNOS活性测定结果Tab.1 Results of the content of NO and eNOS activity in 4 groups of HUVECs ±s

与对照组比较，*1P＜0.05，*2P＜0.01Compared with control group，*1P＜0.05，*2P＜0.01

NO/eNOS/组别含量(μmol·g－1)活性(U·mL－1)

2.2 THSG对HUVECs eNOS mRNA表达的影响THSG可增强eNOS mRNA表达，且呈浓度依赖性。孵育24 h后，1 μmol·L－1THSG可使eNOS mRNA水平增加(P＜0.05);10 μmol·L－1THSG使eNOS mRNA水平显著增加，平均吸光度为对照组的2.2倍(P＜0.01)，结果见图1。

2.3 THSG对HUVECs eNOS蛋白表达的影响THSG可增强eNOS蛋白表达，且呈浓度依赖性。孵育48 h后，1 μmol·L－1THSG可使eNOS蛋白水平增加(P＜0.05)。10 μmol·L－1THSG使eNOS蛋白水平显著增加，平均灰度值为对照组的2倍(P＜0.01)，结果见图2。

3 讨论

NO是一种半衰期很短的自由基分子，在许多生物反应和信号传导途径中发挥重要作用，信使作用最经典的例子是在血管壁，NO从上皮细胞弥散到血管壁平滑肌细胞，激活此处的鸟苷酸环化酶，引起血管平滑肌细胞松弛，血管舒张，还可以抑制血管平滑肌细胞增生和血小板聚集，影响血流等[5]。正常生理状态下，内皮细胞可持续合成和释放NO，调节血管张力。NOS是NO合成的限速酶，在体内，内源性NO是由NOS催化L-精氨酸(L-Arg)转化而成，其合成与降解之间的平衡由L-Arg-NO通路的活性决定。哺乳动物体内存在内皮型(eNOS)、神经型(nNOS)与诱导型(iNOS)3种类型NOS[6]。eNOS主要分布在内皮组织，负责基础NO的合成，内皮细胞产生NO的量受酶活性和(或)eNOS基因表达的调节[3]，激动剂诱导的钙离子(Ca2+)依赖的eNOS活性快速而短暂的增强，可使内皮细胞迅速产生NO，NO含量于数分钟内即达高峰[7]。在生理状态下eNOS表达处于低水平，但可受多种因素调节，包括血流动力学、低氧、雌激素等[8]。

THSG与人工合成的雌激素己烯雌酚具有相似的结构，前期实验发现其具有增强体外血管eNOS活性，增加血管NO含量，舒张血管等。有实验报道[9]，THSG能提高动脉硬化大鼠NO含量及主动脉NOS表达。本实验结果表明，THSG能增强HUVECs中NO含量和eNOS活性，上调eNOS mRNA和蛋白表达，并呈浓度依赖性。实验中1，10，100 μmol·L－1THSG孵育24～48 h所引起的HUVEC mRNA和蛋白表达增多，提示THSG可通过上调血管内皮细胞中eNOS mRNA和蛋白表达，增加NO含量，从而产生舒张血管平滑肌作用。

总之，THSG可上调血管内皮细胞eNOS mRNA和蛋白表达，这可能是THSG增加NO量，舒张血管平滑肌的机制之一。

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