奇异变形杆菌蛋白质双向电泳条件的优化及评价

谢 静，贾庶捷，林 於

（重庆医科大学中医药学院生药学教研室，重庆400016）

奇异变形杆菌蛋白质双向电泳条件的优化及评价

谢 静，贾庶捷，林 於

（重庆医科大学中医药学院生药学教研室，重庆400016）

目的：优化针对奇异变形杆菌蛋白质组学研究的双向电泳 （2－DE）条件及其相关技术体系，阐明样品处理过程中超声功率、振摇时间和上样量对2－DE图谱的影响。方法：选取1株奇异变形杆菌，分别采用超声功率为130W和80W超声法裂解菌体提取总蛋白，将2种方法提取的蛋白在同一条件下进行等电聚焦和聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS－PAGE）；超声功率为80W提取的奇异变形杆菌总蛋白，分别取上样量1和2mg，在同一条件下17cm胶条上进行双向电泳。结果：超声功率为130W处理的样本得到的2－DE图谱中蛋白斑点较少，而超声功率为80W处理的样本蛋白点多、清晰且重复性好。上样量为2mg得到的图谱中横纵条纹明显，蛋白斑点分离度较差，而上样量为1mg时横纵条纹较少，蛋白斑点分离度较好。结论：采用低功率超声且较少上样量处理样品能得到较好的2－DE图谱。

奇异变形杆菌；蛋白质组学；双向电泳

奇异变形杆菌 （Proteusmirabilis，PM）作为肠杆菌科的一员，是复杂性尿路感染的主要病因［1］。奇异变形杆菌和普通变形杆菌可引起人的原发性和继发性感染。近年来关于奇异变形杆菌基因组研究发展迅猛，国内外相继发表了许多关于其基因组学研究成果。蛋白质不仅是基因的表达产物而且作为基因功能的最终体现者，蛋白质组学已成为功能基因组学的主要研究内容之一［2］。双向凝胶电泳 （2－DE）技术最早是在分离大肠杆菌总蛋白时发展起来的，目前已广泛地用于分离哺乳动物细胞、组织和生理体液等复杂蛋白质组，成为蛋白质组研究的核心技术之一［3－4］，但关于奇异变形杆菌蛋白质2－DE条件的优化国内尚外未见报道。本研究选用1株本研究室自存的奇异变形杆菌，优化2－DE实验条件，旨在为后续研究奇异变形杆菌蛋白质组学奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、主要试剂及仪器 第三军医大学生物波研究室自存的奇异变形杆菌菌株1株。LB固体培养基 （100mL）：胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，加蒸馏水至100mL，调pH至7.2～7.4，加入琼脂2g，临用前加入2，3，5－氯化三苯基四氮唑 （TTC）水溶液 （10%TTC、0.4mol·L－1琥珀酸钠、0.36%氯化钠）1mL，20%葡萄糖0.5mL，TTC水溶液和20%葡萄糖以0.75×105Pa灭菌15min。固相pH梯度干胶条（pH 3～10，7cm，17cm）、3－ ［（3－胆酰胺基丙基）二甲基铵基］－1－丙磺酸盐 （CHAPS）、两性电解质 （Bio－Lyte）、三羟基磷 （TBP）、尿素、硫脲、矿物油和碘乙酰胺均购自BIO－RAD公司。十二烷基磺酸钠 （SDS）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、N，N，N′，N′－四甲基乙二胺 （TEMED）、三羟甲基氨基甲烷 （Tris）均为进口试剂，其他试剂为国产分析纯。所有实验过程用水均为超纯水。

1.2 奇异变形杆菌总蛋白的提取 奇异变形杆菌点种于20g·L－1琼脂LB平板，37℃培养18h，方法1：取菌体悬浮于40mmol·L－1、pH 7.5的Tris－Hcl溶 液［6］，4 ℃、10 000r·min－1离 心10min，收集菌体沉淀，加入2mL未加二硫苏糖醇 （DTT）的裂解液 （7mol·L－1尿素、2mol·L－1硫脲、4%3－［（3－胆酰胺基丙基）二甲基铵基］－1－丙磺酸盐 （CHAPS）、0.2% 两性电解质 （Bio－Lyte）、0.001%溴酚蓝）以及10mmol·L－1苯甲基磺酰氟 （PMSF），混悬后置冰水浴中超声破菌，功率130W，每次9s，间歇8s，共15min。每管中再加入200mg·L－1DNaseⅠ、50mg·L－1RNase A和65mmol·L－1DTT，4℃放置30min，然后15 000r·min－1离心30min［7］，将上清按每管100μL分装，－70℃冻存。方法2：裂解过程为功率80W，每次9s，间歇8s，共30min。4℃放置30min后室温振摇过夜。其余处理过程同方法1。采用Brad－ford法测定蛋白含量。

1.3 样品水化 分别采用7和17cm的胶条进行等电聚焦，7cm胶条上样量为500μg，上样体积150μL；17cm胶条上样量为1和2mg，上样体积500μL。不足上样体积用水化上样缓冲液补充（7mol·L－1尿素、2mol·L－1硫脲、4%CHAPS、0.2%Bio－Lyte、65mmol·L－1DTT和0.001%溴酚蓝）。另外加入体积分数为1%的TBP，混匀后，线性上样于溶胀盘中，胶条胶面朝下置于样品上，溶胀1h后，加入矿物油防止样品挥发。水化12～16h。

1.4 固相pH梯度等电聚焦条件 将水化后的样品从溶胀盘转移到聚焦盘，重新覆盖矿物油，设置等电聚焦程序。7cm胶条：①250V，1h，线性；②500V，1h，快速；③4 000V，3h，线性；④ 4 000V，20 000 伏小时 （VH），快速；⑤500V，任意时间，快速。17cm胶条：①250V，1.5h，线 性； ② 1 000V，1.5h， 线 性；③6 000V，2.5h，线性；④ 10 000V，2.5h，线 性；⑤10 000V，60 000 伏 小 时 （VH）；⑥500V，任意时间，快速。

1.5 SDS－聚丙烯凝胶电泳 聚焦结束后，胶条分别在平衡缓冲液Ⅰ、Ⅱ中平衡15min，然后转移至10%SDS－PAGE分离胶上，低熔点琼脂糖封胶液覆盖胶条，待其凝固后，7cm胶条50V、30min，120V至溴酚蓝前沿到玻璃板底部停止。17cm胶条60V、1h，180V至溴酚蓝前沿到玻璃板底部停止。电泳完成后进行考马斯亮蓝R－250染色过夜，脱色至背景清晰，比较蛋白斑点数量、蛋白点分离度、胶上横纵条纹以及背景是否清晰。

2 结 果

采用方法2提取细菌蛋白时，2条7cm胶条上样量为500μg，得到蛋白点清晰、无横纵条纹，且重复性好的2－DE图谱，见图1（插页四）。采用方法1提取奇异变形杆菌蛋白质时，上样量为1mg，经过等电聚焦、平衡、SDS－PAGE和考马斯亮蓝R－250染色，得到的2－DE图谱中蛋白斑点较少 （图2A，见插页四）。考虑对于17cm胶条上样量1mg已足够，检测到的蛋白斑点少不是由于上样量不够，而可能是由于蛋白质溶解不够或处理过程被降解导致。方法1中超声处理功率较高，但处理过程产热较多，会使蛋白质发生降解。另外，方法2提取蛋白质将样品振摇过夜，有利于蛋白质的溶解。按照方法2提取奇异变形杆菌蛋白，2条17cm的胶条上样量为1和2mg，经过相同条件的等电聚焦、平衡、SDS－PAGE和考马斯亮蓝R－250染色，上样量为1mg的2－DE图谱蛋白斑点分离度较好，无明显的横纵条纹 （图2B，见插页四）；上样量为2mg的2－DE图谱横纵条纹明显，蛋白斑点分离度较差 （图2C，见插页四）。

3 讨 论

本实验以奇异变形杆菌蛋白为研究对象进行2－DE分析，并对实验过程中细菌裂解条件、电泳上样量等进行了改进和优化。2－DE最完美的样品制备是保证所有蛋白质在制备过程中不被修饰地大量溶解出来，而且还要在某种程度上与第一向分离兼容，同时排除可能会干扰第一向分离的生物化合物［8］。样品制备主要步骤为细菌裂解，该过程中出现的问题将直接对2－DE的结果产生影响。为了防止蛋白质被破碎的细菌释放的蛋白酶水解，本研究选择在破碎液体中加入蛋白酶抑制剂PMSF。温度变化对蛋白影响较大，选择在冰浴条件下超声破碎提取奇异变形杆菌蛋白质，破碎后又加入RNaseA及DNaseⅠ酶于低温下消化DNA及RNA。由于PMSF在含有巯基的试剂中效果较差 （如DTT），裂解液中的DTT选择在超声裂解完细菌后再加入。本实验所用的细胞裂解液配方是在多次测试后得到的。本研究结果显示：方法2结果优于方法1，但是否存在时间、功率和结果间的正相关性仍需进一步研究。为了保证2－DE图谱中每个点都有足够量用于检测，上样量往往依据样品中蛋白种类多少和胶条种类进行选择，上样量过大会导致图谱出现横条纹，过小则会导致低丰度蛋白不能被检测。有报道［9］指出：外槽液的泄漏也可导致纵条纹的产生。本实验结果显示：对于17cm胶条，1mg上样量得到的蛋白点中可辨别的点较清晰且多，达到了预期效果。考马斯亮蓝染色具有易于操作、重复性好、价格低廉和无毒性等优点，是目前实验室中较为常用的两种显色方法中灵敏度较低的一种。另一种染色方法银染法虽然灵敏度比考马斯亮蓝染色高100倍，但银离子对质谱仪干扰严重，且脱银的方法复杂，不易于掌握，所以银染一般用于分析。鉴于银染过程繁琐且重复性差，加上银染的图像背景清晰度较低，本实验选择采用考马斯亮蓝染色。

随着2－DE技术、生物质谱技术和生物信息学等蛋白质组学研究工具的迅速发展，微生物与蛋白质组学的结合显得顺理成章［10］。微生物蛋白质组学主要研究与微生物活动相关的蛋白质，在不同的环境条件下，微生物相关功能基因组和蛋白质得到表达，用2－DE将其蛋白质分离，比较2－DE图谱差异，鉴定差异蛋白质，确定与活动功能相关的基因，从而阐明基因组功能。尽管1－D图谱和2－D图谱在研究中都能达到目的，但2－D图谱的显著优势在于能提供高分辨率以及对标记蛋白的后续检测［11］。2－DE作为蛋白质组学研究的主要技术，仍然存在着技术上的局限性，尚不能较好处理低丰度及过酸、过碱蛋白。随着技术的革新，该方法将会有更为广阔的应用前景。有研究［12］指出：未来2－DE的目的是确定蛋白质的数量和质量。

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［2］Mullner S，Neumann T，Lottspeich F.Proteomics－a new way for drug target discovery ［J］.Arzneimittelforschung，1998，48 （1）：93－95.

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［4］白瑞霞，王文礼，李丽梅，等.蛋白质组学技术对肝癌HepG2的G2／M期细胞热休克蛋白的鉴定 ［J］.内蒙古医学院学报，2007，29 （5）：332－334.

［5］刘 蕾，刘艳霞，邓 渝，等.同株奇异变形杆菌存在不同的生长状态 ［J］.微生物学杂志，2011，31 （4）：100－103.

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［7］Lee DH， Kim SG， Park YC. Proteome analysis of recombinant Escherichia coli producing human glucagon－like peptide－1 ［J］.J Chromatogr B，2006，849 （1／2）：323－330.

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［11］Smith A，van Rooyen JP，Argo E.Proteomic analysis ofEscherichiacoliassociated with urinary tract infections ［J］.Proteomics，2011，11 （11）：2283－2293.

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Optimization and evaluation of two－dimensional electrophoresis conditions ofProteusmirabilis

XIE Jing，JIA Shu－jie，LIN Yu
（Department of Pharmacognosy，College of Pharmacy，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

ObjectiveTo optimize the conditions of two－dimensional electrophoresis （2－DE）and its related techniques in research on proteomics ofProteusmirabilis，and to elucidate the effects of the supersonic power，the agitate time and the loading amount of proteins on 2－DE maps.MethodsOne strain ofProteusmirabiliswas chosen，and its proteins were extracted by sonicating on a sonicator fitted with a microprobe.and the supersonic powers were 130Wand 80W.The same condition of immobilized pH gradient isoelectric focusing and SDS－PAGE was used to separate the proteins obtained from the two ways.1and 2mg of samples of the total proteins obtained fromProteusmirabilisby 80Wsupersonic power were collected for 2－DE on 17cm IPG strips under the same condition.ResultsThe 2－DE map of the proteins obtained by 130Wsupersonic power was clear，repeatable and had more protein spots than that obtained by 80Wsupersonic power.The 2－DE map with sample amount of 1mg exhibited less vertical and horizontal stripes than that of 2mg， which appeared good repeatability.ConclusionAdopting lower supersonic power and a few of samples can get better 2－DE map.

Proteusmirabilis；proteomics；two－dimensional electrophoresis

R378.2

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1219－04

2012－06－10

国家自然科学基金资助课题 （31070445）

谢 静 （1988－），女，重庆市人，在读药学硕士，主要从事微生物蛋白质组学方面的研究。

林 於 （Tel：023－65712062，E－mail：linyu5819＠163.com）