类鼻疽伯克霍尔德菌致病机制的分子与细胞基础

曹旺斌，贺 英

(河北科技师范学院动物科技学院，河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛，066600)

类鼻疽是类鼻疽伯克霍尔德菌，是广泛分布于热带和亚热带泥土中的腐生菌，农民在田间劳作的过程中通过皮肤粘膜感染引起类鼻疽病(Melioidosis)。类鼻疽伯克霍尔德菌为革兰阴性、有运动性的短杆菌。1911年，Whitmore从仰光38例类似鼻疽的病人中分离获得，命名为类鼻疽杆菌(文章分别发表在1912和1913年)，以后将其归入假单胞菌属(Pseudomonas)。20世纪90年代初日本学者将该菌重新分类，将原假单胞菌属中的DNA群Ⅱ中的几个种列入1个新属伯克霍尔德菌属(Burkholderia)［1，2］。

类鼻疽伯克霍尔德菌致病范围广，人和动物可以通过接触环境中的病原菌，经由摄取、或吸入、或开放的伤口、或皮肤擦伤而感染。能感染的动物包括海洋动物在内的哺乳动物以及某些鸟类，与人类有密切关系的动物如马、牛、羊、猪、犬和猫均有感染报道。本病潜伏期一般为3～5 d，但也有感染后数月、数年，甚至有长达62年后发病，即所谓“潜伏型类鼻疽”，此类病例常因外伤或其他疾病而诱发。临床表现复杂，有急性败血症者常伴多处化脓性损害，慢性者类似空洞型肺结核表现。感染后病变是肺出血、肝脾肿大，有干酪样坏死病灶，雄性动物睾丸肿胀。病情一般较为严重，如不及时治疗，病死率甚高。

类鼻疽伯克霍尔德菌和所有土壤杆菌一样，很难杀死，能在三蒸水中存活数年。该菌能够抑制补体、溶酶体保护机制、阳离子肽，它还能产生蛋白酶、脂酶、卵磷脂酵素、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、溶血素、细胞毒素胞外脂类和至少一种含铁细胞。类鼻疽的死亡率高达39．5%，不治疗的败血症死亡率达80%以上。

本研究从影响细菌致病性的毒力因子和细菌与宿主之间的互作两个方面综述类鼻疽伯克霍尔德菌的致病机理，为该菌的有效控制提供可能的机制。

1 细菌的毒力因子

类鼻疽伯克霍尔德菌的毒力由细胞结合性和分泌性两大类物质因素构成。一般而言，细胞结合性物质是防御性物质，使得细菌本身免受特异性和非特异性免疫因子的杀灭，而分泌性物质直接引起组织器官的病理变化。类鼻疽伯克霍尔德菌能够产生许多与毒力相关的分泌性物质，如蛋白酶、脂酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和溶血素等，其中一些毒力因子也与免疫逃避机制有关。与其他革兰阴性菌相比，对该菌的毒力因子作用机制缺乏深入地研究。有研究发现，Ⅲ型分泌系统和群感知系统与该病原菌的毒力密切相关。由于基因的水平转移或缺失，不同地区的分离株在基因组、转录水平和蛋白质组均有很大差异，表现出了遗传学上的多样性。

1．1 Ⅲ型分泌系统

新近的研究表明，Ⅲ型分泌系统(T3SS)是引起革兰阴性菌致病性的重要毒力因子［3～6］。研究发现，类鼻疽伯克霍尔德菌存在3个Ⅲ型分泌系统，其中T3SS1(BPSS1390-1408)仅在类鼻疽伯克霍尔德菌发现，鼻疽伯克霍尔德菌和泰国伯克霍尔德菌没有;而T3SS2(BPSS1613-1629)和T3SS3(BPSS1520-1554)在这3个种属的伯克霍尔德菌均存在［4］。T3SS1和T3SS2与植物致病性相关，是西红柿感染伯克霍尔德菌必需的毒力因子，而非仓鼠感染所必需。而T3SS3与沙门氏菌和志贺氏菌的Inv/Mxi-Spa系统存在同源性，在鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌感染过程中有重要作用。该基因簇编码的分泌体，功能类似于分子注射器，该系统的亚单位与真核细胞的细胞膜互作，把三型分泌系统的效应分子转移至靶细胞的胞质，然后破坏宿主细胞的细胞周期。体外研究表明，T3SS3能够促进病原菌对健康细胞的入侵、从内涵体的逃脱、在细胞内的存活和繁殖，并且是诱导细菌细胞凋亡所必需的因素。研究发现，伤寒沙门菌的T3SS突变体抑制了细胞的入侵和肠病发生。T3SS3突变的病原菌仍能够从内涵体逃脱，但与野生型相比，在时间上延迟。细菌内化后，从内吞体逃脱进入细胞浆感染细胞。在一极诱导肌动蛋白聚合形成膜突出从而发生细胞间的传播。缺乏Bsa分泌和转移系统的类鼻疽伯克霍尔德菌突变体，降低在鼠类巨噬细胞的复制，不能从内吞体逃脱、形成膜突出和肌动蛋白聚合;BopE是与沙门菌SopE/SopE2同源的蛋白，该蛋白是鸟嘌呤核苷酸交换因子，失活该蛋白，可以减弱细菌进入Hela细胞的能力，说明BopE促进细菌入侵。此外，类鼻疽伯克霍尔德菌bsa位点编码的沙门菌sip转移子同源蛋白(BipB，BipC，BipD)，这些蛋白是沙门菌效应蛋白注入和细菌入侵上皮细胞所必需的［5］。突变类鼻疽伯克霍尔德菌的bipD基因，该菌入侵上皮细胞的能力削弱。缺失转移系统的BipD突变体，病原菌腹腔内或鼻内感染BALB/c小鼠的能力减弱，在肝脏和脾脏的繁殖能力降低［6］。有研究表明［7］，BipB介导了多核大细胞的形成，细菌的细胞间传播，以及被感染的宿主细胞的凋亡。BipB突变体病原菌削弱了BALB/c小鼠的鼻内感染。

最新的研究表明，Ⅵ型分泌系统(Type VI Secretion System，T6ss)也是伯克霍德尔菌的毒力基因决定簇，T6ss基因簇编码15～20个蛋白参与分泌系统的组装、结构和功能［8］。在类鼻疽伯克霍尔德菌的T6SS命名为tss-5，能够诱导病原菌在巨噬细胞的生活周期;突变或缺失该基因，能够减少细菌在上皮细胞的噬斑和细胞间的传播。因此认为tss-5是类鼻疽伯克霍尔德菌的重要毒力决定簇，但关于这个分泌系统的效应分子目前还不清楚。

1．2 群感知系统

大多革兰阴性菌通过产生N-乙酰同型丝氨酸(N-acyl-homoserine lactone，AHL)信号分子来监控其自身在群感知系统中的群体密度。通常，高群体密度引起一系列后果，如致病需要的毒力因子功能的表达，这种基因调控的形式确保细菌保留在宿主的免疫系统中。直到他们足够高的密度以压倒宿主，并建立感染。

在B菌种存在这些信号分子的证据源自交叉培养试验，结果发现，AHL包含的营养耗竭的培养基能够刺激含铁细胞、蛋白酶和脂酶的产生［9］。B菌第1个QS基因发现于转座子突变的扫描中。BK56-2菌的QS系统由AHL合成酶CepI和转录调控子CepR组成，前者酶指导合成N-庚酰同型丝氨酸(C8-HSL)，检测N-己酰同型丝氨酸(C6-HSL)的产生。在低种群密度时，细胞通过激活CepI合成酶产生基础水平的AHLs，随着细菌密度增加，AHL信号分子在生长介质中积累，当达到一个界限浓度，AHL结合到同源LuxR型受体蛋白CepR，从而诱导或抑制靶基因。CepR紧密控制cepI的表达，主要通过结合到lux盒子类似序列，该序列与cepI启动子的-35区部分重叠。这种正反馈调节保证一旦该系统启动，靶基因表达快速增加［10］。

研究B菌的群感知系统揭示，CepI/CepR系统正调节细胞外蛋白酶、壳多糖酶、多聚半乳糖醛酸酶的表达，菌群的运动，菌膜的形成，抑制铁细胞分泌蛋白的合成。B．H111群感知系统缺陷的突变体仅形成平的未分化的生物膜。进一步定量分析生物膜结构表明［11］，CepI/CepR系统不参与细胞在非生命体表面的吸附，但控制生物膜的成熟。CepI/CepR系统影响B菌在不同宿主的毒力。

细胞密度依赖的群感知系统使用N-酰基同型丝氨酸内酯(AHLs)调节基因表达，LuxI负责AHL的生物合成，LuxR是转录调节因子，还有一些同源的AHLs。这些蛋白因子参与基因表达或抑制基因表达。据报道，类鼻疽伯克霍尔德菌基因组包含3个LuxI和5个LuxR群感知系统同族体。质谱分析类鼻疽伯克霍尔德菌培养物的上清液表明，该上清液存在许多信号分子，包括N-癸酰同型丝氨酸内酯和N(3辛-癸酰)-L-同型丝氨酸内酯。破坏群感知系统的这8个同源基因导致腹腔内接种的叙利亚大鼠的半数致死量明显增加，延长了BALB/c小鼠从接种到死亡的时间，减少了病原菌对器官的侵袭。命名为PmlI-PmlR的LuxI-LuxR同源体，指导N-癸酰同型丝氨酸内酯的合成，参与调解金属蛋白酶合成，是该菌实验动物感染模型的毒力所必需，最佳毒力发挥和外源毒素分泌也需要同源物BpsI-BpsR的参与［12］。有些群感知系统控制潜在毒力因子和致病过程，如含铁蛋白、磷酸酯酶C和菌膜的形成等都可能依赖于BpeAB-OprB，类鼻疽伯克霍尔德菌中众所周知的一种多药外排泵系统，与该菌的抗生素耐药性如氨基糖苷和大环内酯物的抗性有关。由于N-癸酰同型丝氨酸内酯和N-辛酰同型丝氨酸内酯能够诱导BpeAB-OprB的表达，群感知系统调节BpeAB-OprB操纵子。BpeAB突变体弱化了该菌的细胞入侵和人类肺上皮细胞(A549)和人巨噬细胞(THP-1)的细胞毒性［13］。

1．3 荚膜多糖

类鼻疽伯克霍尔德菌的荚膜在普通光学显微镜下很难发现，在电子显微镜下可见到细菌外部附有一层丝状物——荚膜多糖，由1，3键相连的多聚2-O-己酰基-6-脱氧-β-D-甘露糖-庚吡喃糖残基构成，先前认为是I型O抗原多糖，现在基于高分子群体和遗传相似性研究更倾向于是荚膜多糖。荚膜多糖是类鼻疽伯克霍尔德菌实验动物感染模型毒力所必需的。与野生型相比，在血清存在时诱导荚膜表达或在血清杀菌检测中加入荚膜，能够使类鼻疽伯克霍尔德菌SLR5(一种血清敏感菌株)的存活增加1 000倍。有荚膜的菌株和没有荚膜的变异株在吞噬细胞吞入率尚没有明显差异，其荚膜的抗吞噬作用主要表现在抗溶菌酶体功能上，这一现象是类鼻疽潜伏期可长达数10年之久的原因之一。有学者以同源重组的原理构建了荚膜基因缺失突变株，试验证明荚膜的缺失导致补体C3b在菌体表面的沉积增多［14］。另外，荚膜还与该菌对环境的抵抗力和抗生素抗性有关。

1．4 脂多糖

脂多糖是先前命名的Ⅱ型O抗原多糖，类鼻疽伯克霍尔德菌的脂多糖似乎与其他革兰阴性菌不同。与其他肠杆菌的脂多糖相比，该菌的脂多糖在啮齿类动物的产热活性减弱，但增强了鼠类动物脾细胞的促有丝分裂活性。与埃希大肠杆菌的脂多糖相比，该菌的脂多糖体外介导肥大细胞活化能力减慢［15］。

类鼻疽伯克霍尔德菌的O抗原分为I型和Ⅱ型。I型O抗原由1，3键相连的多聚2-O-己酰基-6-脱氧-β-D-甘露糖-庚糖残基构成。Ⅱ型 O 抗原由多聚(-3)-β-D-葡萄糖-(1，3)-脱氧-α-L-太罗糖构成［16］。Ⅱ型O抗原基因缺失突变株对糖尿病模型动物的LD50比野生型大140倍，所以Ⅱ型O抗原可能是该菌毒力的影响因子［17］。虽然人和动物的补体能够在菌体表面形成膜攻击复合物，并且完成外膜打孔，但整体而言该菌有着很强的抗补体杀灭机制。近期的研究表明，Ⅱ型O抗原是抗补体杀灭作用的分子基础。

1．5 Ⅳ型菌毛

Ⅳ型菌毛是许多革兰阴性菌的重要毒力因子，与细菌的黏附有关。类鼻疽伯克霍尔德菌K9624基因组包含多个Ⅳ型菌毛相关位点，其中包括1个公认的菌毛结构蛋白PliA。体外研究表明，类鼻疽伯克霍尔德菌可以附着于人类肺泡、支气管、喉部、口腔、结膜和子宫组织的上皮细胞系，而且30℃时接种细菌对这些上皮细胞的黏附能力比37℃更强。与其他伯克霍尔德菌相比，该菌对呼吸道上皮细胞的入侵、黏附和细胞损伤更有效。缺失PliA蛋白，减少了细菌对人上皮细胞的黏附性、线虫毒力模型的毒力以及鼠类类鼻疽发病，这些结果说明Ⅳ型菌毛在类鼻疽伯克霍尔德菌的毒力中起一定作用［18］。

1．6 鞭毛

类鼻疽伯克霍尔德菌鞭毛的氨基酸序列已经清楚，碳端和氮端的氨基酸较为保守，中间部分的氨基酸序列具有一定的可变性，因而编码这一段氨基酸序列的基因引起研究者的关注。有体外研究表明，野生型和鞭毛突变体病原菌在人肺细胞的入侵和复制没有不同;而其他研究者的活体研究得出不同的结果，以转座子诱变技术构建了类鼻疽伯克霍尔德菌鞭毛基因(filC)缺失突变菌株，试验结果表明该菌株丧失了运动性，与原始菌株相比，失去对BALB/c小鼠的致病性，无论是通过鼻腔接种还是腹膜内接种均不能引起发病;而另外的研究得出，野生型和鞭毛基因突变体在糖尿病小鼠和叙利亚大鼠的感染模型没有差异［19］。

2 宿主的免疫机制

类鼻疽伯克霍尔德菌感染后机体能够产生针对荚膜多糖、O-PS多糖和鞭毛蛋白等抗原成分的特异性抗体，抗体种类以IgG为主。这些抗体有一定的保护作用，但小剂量感染和持续暴露在污染环境所激发的抗体不足以避免病原菌的初期感染和复发。类鼻疽的保护性免疫以细胞免疫为主。

2．1 嗜中性粒细胞

血液中的嗜中性粒细胞是抗菌免疫的重要机制，对类鼻疽伯克霍尔德菌而言存在较多争议。我国的研究者用电镜观察了模拟菌血症条件下健康人嗜中性粒细胞吞噬和杀灭类鼻疽伯克霍尔德菌的过程。在细菌被吞入的初期，细菌形态完整，吞噬体和菌体大小一致。随着杀灭功能的进行，吞噬体变得很大，其内的细菌呈松散状，形态结构已发生很大改变。在杀灭作用的后期，于吞噬体内仅见残留的细菌碎片。这一结果说明健康人的嗜中性粒细胞能够杀灭类鼻疽伯克霍尔德菌［20］。

2．2 CD4+T 细胞

有研究认为，抗原诱导的CD4+T细胞免疫反应在感染后期起主要作用［21］。患有类鼻疽的病人，其IgG，IgA和IgM的水平与疾病的严重性呈正相关。与局部感染的病人相比，全身浸润的病人抗体水平更高。类鼻疽与特异性人白细胞抗原(HLA)二类分子存在关联。HLA二类分子DRBI1602与急性败血型类鼻疽呈正相关，而DQA1*03与其呈负相关。由于类鼻疽伯克霍尔德菌抗原反射性增强了淋巴细胞增殖和INF-γ的产生，类鼻疽恢复的患者表现抗原特异性的细胞免疫反应。测定类鼻疽伯克霍尔德菌抗原淋巴细胞反应显示，与曾经患过类鼻疽的人相比，无临床症状的潜伏期患者表现较强的细胞介导的适应性免疫反应。CD4+T细胞产生的INF-γ激活了巨噬细胞，从而使巨噬细胞具有更强的杀菌活性，也就是说，INF-γ增强了巨噬细胞的细胞内杀菌活性。最近的研究表明，类鼻疽伯克霍尔德菌特异的CD4+T细胞在鼠类宿主感染后期抑制病原菌起到重要作用。但对CD4+T细胞在控制病原菌感染方面的重要性仍存在公开的争议。因为目前没有发现HIV和类鼻疽感染之间存在相关性。

2．3 补体系统

众所周知，补体系统在抗革兰氏阴性菌感染中发挥着重要的作用。补体系统对革兰阴性菌外膜的直接损伤被认为是补体系统杀灭革兰阴性菌的重要环节，细菌的最终死亡有赖于随后的一系列生物学过程。类鼻疽伯克霍尔德菌能够快速和有效的激活补体。补体的激活导致C3补体在细菌表面沉积并进一步调理化。粒细胞和巨噬细胞对类鼻疽伯克霍尔德菌的黏附和吞噬作用依赖于调理素的存在和巨噬细胞膜上表达的补体受体CR1和CR3的参与。荚膜多糖通过减少补体因子C3b的沉积抵御吞噬作用。但是有资料表明类鼻疽伯克霍尔德菌有抗补体的作用。类鼻疽伯克霍尔德菌能够抑制补体的细胞溶解酶活性，其他致病菌如包柔螺旋体菌、沙门菌、奈瑟菌以及链球菌均有该特性。补体成为类鼻疽伯克霍尔德菌体内潜藏的场所。补体能够增强吞噬作用，但有证据表明，类鼻疽伯克霍尔德菌可在吞噬细胞内存活和繁殖，包括巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞，利用多种机制逃避巨噬细胞的杀菌作用和宿主细胞的免疫作用，这些机制包括抵抗人的防御蛋白和抑制细胞内DNA和蛋白质的合成。超微结构研究发现，病原菌能够存在于膜结合体特别是吞噬溶酶体，从而能在酸性环境中生存与生长;被吞噬的病原菌能够阻止吞噬体和溶酶体的融合并在15 min内破坏吞噬体的膜结构，这种现象在类鼻疽感染患者体内也得到证实。当巨噬细胞与大肠杆菌、沙门菌等病原菌作用时，可诱导产生一氧化氮合酶和α-肿瘤坏死因子，但类鼻疽伯克霍尔德菌可阻碍诱生型一氧化氮合酶的表达，并抑制细胞因子的产生，从而产生对抗巨噬细胞的杀菌作用。在感染类鼻疽伯克霍尔德菌的人类组织中，偶尔可见多核巨细胞和大的巨噬细胞，这可能是由于病原菌在巨噬细胞内的存活，细胞半衰期延长，降低了细胞的杀菌能力。类鼻疽伯克霍尔德菌可诱导蛋白酶依赖的宿主细胞死亡，逃避巨噬细胞的杀菌作用;而细胞死亡伴随IL-1β和IL-18的释放。在保护性生物膜中胶囊化的菌落也可延长细菌在静止状态的生活周期［21～23］。

2．4 细胞因子

细胞因子在类鼻疽伯克霍尔德菌感染的免疫保护反应中起到重要作用，临床研究证明，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)能够提高重症类鼻疽患者的存活率。糖尿病能够损害嗜中性粒细胞的趋化、吞噬和杀伤功能。其他风险因素如地中海贫血、酒精中毒、慢性肾功能衰竭等也有相似作用。G-CSF的使用能够对抗这些不利因素的影响［24］。

促炎症细胞因子γ干扰素(INF-γ)在早期抵御类鼻疽伯克霍尔德菌感染具有重要作用［25～27］。抑制鼠表达INF-γ，其ID50从5×106降低至2 CFU，而且肝脏细菌数增加8 500倍，脾脏细菌数增加4 400倍。抑制INF-γ内源生成诱导因子IL-12和IL-18表达，增加了同型动物感染模型的死亡率。细胞内感染类鼻疽伯克霍尔德菌主要引起1型T细胞免疫反应(Th1)，产生多种细胞因子，其中INF-γ，IL-12和IL-18最先产生。这些细胞因子能够增强吞噬和胞内菌的杀伤作用。细胞毒T淋巴细胞和NK细胞等效应细胞在INF-γ的作用下，能促进感染病原菌细胞的凋亡。INF-β能够促进诱生型一氧化氮合酶的表达，增强巨噬细胞的抗菌活性。另一个重要的促炎症细胞因子肿瘤坏死因子(TNF-α)在类鼻疽伯克霍尔德菌感染的早期免疫也起到重要作用。抵抗巨噬细胞源细胞因子的被动免疫增加了实验感染鼠的死亡率;类鼻疽患者血清中的INF-γ，IL-12和TNF-α浓度升高。TNF-α启动子的多态性与类鼻疽感染存在与否及感染严重性有关。

3 展 望

尽管关于类鼻疽发病机制有许多较为详尽的研究，也有众多研究者从假定毒力因子及其病原宿主免疫互作方面进行了诸多探讨。基因组信息和芯片分子技术工具的采用，该病原菌的分子和细胞致病机制的探索也初见成效。然而从Whitemore发现鼻疽伯克霍尔德菌至今，其感染发病的每一个过程仍有许多问题尚未探明。未来的研究应着重从以下几个方面进行:(1)进一步明确鼻疽伯克霍尔德菌对上皮细胞和巨噬细胞的吸附、入侵和细胞内存活机制;(2)进而了解细菌传播的机制;(3)探索细菌如何与免疫系统互作导致疾病暴发的机制，这是开发多功能疫苗的基础。

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