BCL-2家族在缺血性脑血管病中的抗凋亡作用

杜圆圆1综述，罗永杰2△审校

(1.泸州医学院，四川泸州646000;2.四川省医学科学院·四川省人民医院神经内科，四川成都610072)

BCL-2家族在缺血性脑血管病中的抗凋亡作用

杜圆圆1综述，罗永杰2△审校

(1.泸州医学院，四川泸州646000;2.四川省医学科学院·四川省人民医院神经内科，四川成都610072)

目前由于脑缺血的高发病率、高死亡率，许多学者对其进行深入研究，发现脑缺血后神经损伤中除坏死外，还存在神经元凋亡现象。细胞凋亡是由基因调控的细胞主动死亡过程，神经元死亡分为两个阶段，其第二阶段为迟发性死亡(delayed neuronal death，DND)，即在脑缺血中，神经细胞在再灌注后数小时甚至数天后才发生死亡。Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡过程中具有重要的调控作用，其抗凋亡蛋白成员和促凋亡蛋白成员之间的协同作用，共同决定细胞是否进入凋亡程序。其表达的变化对细胞的命运起决定作用。

脑缺血;BCL-2家族;凋亡

1 Bcl-2家族蛋白质的一般特性

1.1 Bcl-2家族成员及其分类Bcl-2家族分为三个亚族:原生存亚族(pro-survival subfamily)即Bcl-2亚族，成员有Bcl-2、Bcl-Xl、KS-Bel-2、Bcl-w、Mcl-1、BHRF1、NR-13、ORFl6、LMW5-HL、AI、EIB-19K及CED-9;两个原凋亡亚族(proapoptotic subfamily)是Bax和BH3亚族。Bax、Bak及Bok属于Bax亚族，Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Bim、Bad、Bid及EGL-l属BH3亚族［4］。其中15种蛋白为哺乳动物(主要是人)所有，NR-13为鸡类所有，线虫C.elegans中的蛋白有CED-9及EGL-l，病毒蛋白有LMW5-HL、BHRFl、ORF-16、KS-Bcl-2和EIB-19K。

1.2 Bcl-2相关蛋白结构Bcl-2基因是B细胞淋巴瘤/白血病-2的缩写，Tsujimoto等［5］于1984年从滤泡性淋巴瘤和白血病细胞中分离出来的一种原癌基因。正常情况下，Bcl-2基因位于18q21，含有3个外显子和2个开放阅读框架(启动子)。第一个外显子不翻译，蛋白编码区为外显子2、3。基因组DNA的外显子2被一个＞50 kb的内含子隔成两部分，转录时这一内含子序列被剪切掉。Bcl-2基因转录6.0 kb的mRNA，经不同拼接，翻译为由239个氨基酸残基组成、分子量为26kd的Bcl-2a和21kd的Bcl-2B两种相似的蛋白。其结构特点是在梭基端有一个由19个疏水氨基酸组成的疏水性片段，能使Bcl-2蛋白插入膜结构中，并有多个高度保守功能片段:S-N，SⅡ/SⅡ-C，BH1和BH2。免疫组化及共聚焦显微镜、激光扫描显微镜和电子显微镜观察发现，Bcl-2蛋白位于核膜、粗面内质网和线粒体膜上［6～8］。Bcl-2基因是一种强有力的细胞死亡抑制因子，其成员在细胞凋亡中的作用分为两类:一类为抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等;另一类为促凋亡蛋白，包括Bax、Bak、Bid等。Bcl-2家系的成员均由1-4个Bcl-2同源区域(Bcl-2 homology domain，BH)构成，BH1-BH4均具有α螺旋结构。到目前为止，发现所有抗凋亡因子均具有BH1到BH4 4个同源区域，而促凋亡因子均缺乏第一个α螺旋片段—BH4区域［9，10］。BH3区域对于促凋亡因子来说似乎是最重要的功能区，因为目前已经发现促凋亡因子Bid、Bad和Bim等只有BH3区。另外，许多Bcl-2成员羧基端存在一个疏水区域(carboxy-terminal hydrophobic，TM)，它决定了Bcl-2家族蛋白的生物膜靶向性［11］。家族各成员之间可以形成同源或异源二聚体，抗凋亡蛋白成员和促凋亡蛋白成员之间的协同作用，共同决定细胞是否进人凋亡程序。

1.3 Bcl-2的生物功能Bcl-2基因在许多胚胎组织中广泛表达［12］，但在成体组织中，Bcl-2似乎在迅速分裂并分化的细胞中表达，这类细胞包括肠上皮或皮肤隐窝的干细胞以及造血祖细胞。在成熟的细胞或处于将被消除的阶段的细胞中，bcl-2的表达下降。例如在角质化细胞或髓细胞分化过程以及在B和T细胞分化过程中，当这些细胞即将通过凋亡而发生克隆性消亡时，Bc1-2均下调。有人据此假设Bcl-2是早期始祖细胞或长寿命的已充分分化的细胞的存活因子。另一方面，在组织分化过程中。Bcl-2的下调似乎促进在克隆选择期间发生的或者与上皮或造血细胞的终未分化相关的细胞死亡。Bcl-2蛋白的生理功能主要是抑制细胞凋亡，延长细胞寿命，而不影响细胞周期和分化进程，这对于维持体内某些需长期生存的细胞如神经元、免疫记忆细胞、造血干细胞等的寿命具有重要意义［13］。

2 Bcl-2抗凋亡作用机理

Bcl-2蛋白定位于线粒体膜、内质网膜和核膜上，具有离子通道和停靠蛋白的双重功能，它在介导细胞凋亡的途径中起关键作用。线粒体在细胞凋亡过程中发挥非常重要的作用，Bcl-2蛋白在线粒体膜上从三个方面抑制细胞凋亡:①Bcl-2能改变线粒体巯基的氧化还原状态来控制其膜电位从而调控细胞凋亡。在细胞凋亡中，线粒体的巯基可能组成了胞内氧化还原电位的传感器，Bcl-2可能是通过抑制谷胱甘肽(GSH)的外泄，降低胞内的氧化还原电位，来抑制细胞凋亡的;②Bcl-2能调节线粒体膜对一些凋亡蛋白前体的通透性。Bcl-2蛋白可能是线粒体PT孔道的组成成分，它在较高pH的条件下能形成离子通道，而Bax则能在较为广泛的pH范围内形成孔道。Bax能允许一些离子和小分子如细胞色素c等穿过线粒体膜，进入细胞质，从而引起细胞凋亡，而Bcl-2的作用正好相反，它能封闭Bax形成孔道的活性，使一些小分子不能自由通透，从而保护细胞凋亡;最新研究认为，细胞质存在诱导转录因子，可介导细胞质基因表达来调节细胞的生存［14］。③bcl-2能将凋亡蛋白前体Apaf-1等定位至线粒体膜上，使其不能发挥凋亡作用。实验证明，尽管Bcl-2与胱冬肽酶之间无亲和力存在，但当二者在细胞中同时表达时却发现它们之间有相互作用。这种作用可能是间接的，是通过第三者CED-4来实现的。Bcl-2能与线虫中的CED-4结合并抑制其功能，而Apaf-1具有与胱冬肽酶结合的功能域，能参与细胞色素c依赖的胱冬肽酶激活。这表明Apaf-1就象线虫中CED-4一样，一方面能激活胱冬肽酶引起凋亡;另一方面又作为接头蛋白能把Bcl-2相关蛋白与胱冬肽酶聚集在一起，并使胱冬肽酶失活，从而保护细胞凋亡［15］。其次，Bcl-2蛋白在内质网上也发挥着重要作用，通过调控内质网Ca2+参与的核内外物质转运及膜通透性转换(PT)来阻止细胞色素C从线粒体中释放，达到阻止细胞凋亡的级联反应过程［16、17］，从而阻断细胞凋亡。

3 脑缺血后Bcl-2家族的表达及意义

缺血性脑血管病的发病机制包括能量耗竭、酸中毒、兴奋性氨基酸毒性作用，细胞内钙超载、氧自由基、炎症细胞因子介入、细胞凋亡等多个方面［18］。脑缺血程度决定细胞死亡方式，严重缺血引起细胞能量耗竭，细胞内钠、钙升高导致细胞坏死，轻微缺血及再灌注损伤则易触发凋亡［18］。脑缺血后，神经元坏死与凋亡并存，细胞坏死位于缺血中心区，细胞凋亡主要出现在缺血周边区;而在脑缺血的迟发性神经元死亡期，则以细胞凋亡为主。凋亡可能决定了最终梗死体积。研究表明，Bcl-2基因是脑缺血神经元凋亡调控基因的重要组成部分。Bcl-2的过度表达能明显抑制缺氧所介导的神经元死亡［19］，其参与神经细胞的分化发育调节，并且可以促进视神经节细胞轴突的生长和再生。通过基因敲除、转基因动物和基因转染等实验发现，具有明显的抑制细胞凋亡作用和神经保护作用。shimazaki等［20］研究短暂性缺血后沙土鼠海马中Bcl-2蛋白表达发现，在缺血2分钟后，海马CAI区Bcl-2蛋白的免疫反应活性增加，诱导了对继发性缺血的耐受性，并阻止了迟发性神经元死亡;然而缺血5分钟，Bcl-2蛋白免疫反应活性下降，在海马CAI区可出现神经元死亡。但是，先用缺血2分钟处理后恢复血流，再继发缺血5分钟，则可阻止第2次缺血后迟发性神经元死亡，从而认为短暂性缺血后海马CAI区获得的对迟发性神经元死亡的抑制与Bcl-2蛋白有密切的关系。Chen等［21］对大鼠缺血60 min及120 min后再灌流24小时Bcl-2表达进行了观察，结果发现缺血60 min组在大脑皮层可有Bcl-2蛋白表达，缺血120 min组，可发现小胶质细胞，内皮细胞和血管壁均有表达，这说明脑缺血中没有受到致命损伤细胞可诱导Bcl-2表达。而Bcl-2只表达在肯定能存活的神经元上。Bcl-2表达的上调也许反映了一种保护神经元积极生存的机制。

在研究Bcl-2蛋白及其作用机制时，发现一种相对分子质量为21 000的蛋白，命名为Bax;bax基因5'非翻译区有4个p53结合位点，编码区含有Bcl-2蛋白高度同源的BHI和BHZ结构域，是bax自身和Bcl-2家族其他成员形成同型或异型二聚体，促进细胞凋亡［22］。Krajewski等［23］在全脑缺血再灌流模型着重观察了bax蛋白变化。他们发现全脑缺血10 min后再灌流0.5～3小时时，各脑区神经细胞逐渐呈变性改变，bax免疫染色明显增强。利用双标法同步分析bax蛋白和原位DNA片段在缺血细胞中的变化，发现进行凋亡的神经元bax蛋白免疫呈高表达，主要存在于海马CA1区及小脑purkinje细胞。他们也发现变性神经元Bcl-2免疫反应下降，尤其是Bcl-x，因此他们认为Bcl-2家族某些基因决定DND的发生。Sermadias等［24］认为Bax不仅能和Bcl-2形成二聚体抑制凋亡，而且其自身还能形成二聚体诱导凋亡，Bax蛋白过度表达时bax同源二聚体增多，对诱导凋亡的刺激因素更加敏感。bax有对抗hcl-2，促进凋亡的功能。并有研究发现细胞内这两种蛋白之间的动态关系可以用Bcl-2/Bax比率来表示，而Bcl-2/Bax比率的高与低可能决定细胞在受到凋亡刺激信号后是趋向于存活或死亡，即Bcl-2/Bax＞1时，对细胞凋亡起抑制作用，细胞趋于存活;Bcl-2/Bax＜1时，对细胞凋亡起促进作用，细胞趋于死亡［25～27］。

4 展望

细胞凋亡是缺血性脑损伤中细胞死亡的途径之一，而Bcl-2家族蛋白在其不同成员相互协同作用下，发挥抗凋亡或促凋亡作用。在脑缺血损伤早期采用转基因、HSV载体或其他新的病毒载体、以及神经保护剂如IL-8单克隆抗体［28］等积极的方法，增加Bcl-2等抗凋亡基因的表达，有可能成为今后临床治疗缺血性脑血管病的一个新方法。此外，Bcl-2基因在某些情况下并不能阻止细胞凋亡，如不能阻止肿瘤坏死因子(TNF)等介导的细胞凋亡，这也揭示细胞凋亡的复杂的分子机制，还需进一步研究。

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Anti-apoptotic effects of BCL-2 family in ischemic cerebrovascular disease

DU Yuan-yuan，LUO Yong-jie

R743.31;R329.25

B

1672-6170(2012)05-0219-04

2012-04-21;

2012-05-21)

△通讯作者，硕士生导师