噬菌体治疗细菌感染的研究进展

秦天呈 姚彬 王文 滕燕 孟俊杰 曾蔚

（1.四川大学华西基础医学与法医学院2009级基础医学专业基地班，四川 成都 610041；2.四川大学华西基础医学与法医学院微生物学教研室，四川 成都 610041）

1 噬菌体早期研究实验

噬菌体是由英国细菌学家Twort（1915）及法裔加拿大细菌学家D’Herelle（1917）分别发现的一类细菌病毒。他们在研究中发现，噬菌体具有使宿主细菌裂解的现象，从而提出了噬菌体应用于治疗的可能性［1］。早在D’Herelle发现噬菌体的当年，他就在临床上进行了第一次噬菌体治疗实验，其有效性得到了证明，但由于此次实验缺乏严格的实验设计，因而不被科学界所认可［2］。而后，D’Herelle又用直接注射的方法使四名患有鼠疫的病患全部康复［3］。早期的噬菌体研究主要集中在苏联和东欧，但由于抗生素的出现和世界政治格局的变化，噬菌体的研究逐渐停滞不前。

六十年代末，我国医学工作者用噬菌体治疗烧伤引起的铜绿假单胞杆菌感染，取得了很好的效果［4］，七八十年代以来，西方国家大量的动物实验也让人们深刻的意识到：噬菌体作为抗感染生物制剂，在临床上的应用是有一定前景的［5，6］，甚至可能作为继抗生素之后，人类对抗细菌感染的又一有效武器。

2 噬菌体的当代研究状况

近年来，随着抗生素的治疗效果日趋下降，耐药菌种的不断出现，世界各地的研究人员又将目光重新聚集到了噬菌体的身上。使噬菌体不仅在抗感染的治疗中发挥巨大作用，在临床的各种检测中也作出了卓越的贡献。2003年，美国就发现第一例抗万古霉素的金葡，而在利用小鼠模型作为检验应用噬菌体治疗效果时，显示了噬菌体具有显著的保护作用［7］。而在2011年，巴斯德实验室发表的关于噬菌体治疗铜绿假单胞菌感染引起的肺囊性纤维化小鼠模型的实验论文中，也证实应用噬菌体治疗取得了很好的治疗效果：在有效治疗剂量作用下，2小时后小鼠的存活率达到95%，而在四天的正常治疗剂量后，治愈率可达100%［8］。

(1)燃油管路、燃油滤清器进入空气或阻塞按前术方法排空气或更换燃油滤清器芯子。(2)喷油泵供油不良检查修理或更换偶件。(3)喷油器雾化不良或油压力低进行喷雾观察或调整喷油压力，并检查喷油嘴偶件或更换。

3 噬菌体杀菌机制及特点

噬菌体有严格的宿主特异性，不能感染人体内的细胞，仅寄居在易特异宿主菌体内。噬菌体具有高度的特异性，一种噬菌体往往只侵染一种细菌，或只侵染某一菌株。按生活周期可将噬菌体可分为烈性噬菌体和温和噬菌体两种类型。侵入宿主细胞后，引起宿主菌快速裂解的噬菌体被称作烈性噬菌体。另一种称为温和噬菌，其侵入宿主细胞后，可以出现两种反应，一种是与烈性噬菌体相同的裂解反应，另一种则是以前噬菌体的形式附着并整合在宿主菌的染色体上，使宿主菌不裂解而继续生长，表达病毒基因。从噬菌体治疗的角度考虑，温和噬菌体的可利用价值不高，故通常提到的噬菌体为烈性噬菌体。

噬菌体制剂通过离心就可以去除细菌碎片得到纯化，易于保存和运输。且从进化的观点来看，完全可以通过自然选择来筛选噬菌体治疗耐药或耐噬菌体的细菌感染，这是抗生素所无法比拟的。

第三，形成了一些比较有效的课堂规范，但也有一些课堂规范阻碍了学生的自由发展.张老师经过多年的教学实践，形成了自己的一套课堂教学规范.如一个学生在回答问题时，要求其他学生保持安静，待这位学生讲完后再发表意见.这样的课堂规范，有利于养成学生学会倾听，并对他人的观点进行思考的习惯.但是还有一些课堂规范不利于学生的自由发展，如要求学生想到解答方法或获得答案后不能随便发言，等老师点名后才可以回答；再如，要求学生统一解题思路后，再动手做题.

其中:x(t)=(x1(t),x2(t),…,xN(t))T为N 维状态向量;u(t)=(u1(t),u2(t),…,um(t))T为控制向量;mN；f(x(t),u(t),t)=(f1(x(t),u(t),t),f2(x(t),u(t),t),…,fN(x(t),u(t),t))T为N维实值函数向量.为了研究问题的方便,引入广义状态空间的概念.

工序加工能耗包括工序加工过程中的切削过程能耗、空切过程能耗、工件装夹过程能耗和磨顿换刀过程能耗[11]。因此，调度过程中的工序加工能耗

3.1 吸附识别和穿入

抗生素多数是以破坏致病菌与非致病菌为目标的广谱性药物，因而很可能破坏机体或目标环境的菌群平衡，从而导致严重的二次感染。传统抗生素治疗在杀灭致病菌的同时，也破坏了消化道及泌尿生殖道等部位的正常菌群，从而导致菌群失调，引起机会性感染甚至更严重的全身性感染。而噬菌体拥有严格的宿主特异性［11］，只针对相应的宿主菌，而不会破坏正常菌群，避免二次感染。

3.2 溶菌

通过对噬菌体的溶菌基因及溶菌过程的研究初步认为，噬菌体对其宿主菌的溶解是由专一溶解基因编码的特异性蛋白或噬菌体自身蛋白介导的溶解系统统一完成的，这一溶解系统具有一套完整、精密的调节机制和控制体系，而且其作用基质多集中宿主菌的细胞壁上，噬菌体蛋白通过不同的途径影响和破坏宿主菌胞壁质的生物合成及正常结构，从而导致噬菌体宿主菌细胞损伤、死亡。

噬菌体对细菌的感染效率惊人，重复4个感染周期后，一个噬菌体颗粒可杀灭数10亿个细菌，这是噬菌体极具特色的一种生物学特性。由于具备强大的杀菌能力，噬菌体在治疗细菌感染、消毒以及反生物武器等领域具有良好应用前景。

4 噬菌体作为治疗性制剂的优势

抗生素作为上个世纪发现的药物，随着大量的生产和使用，对细菌造成了选择性的压力，在我国及世界各地都接连发现了耐药的、甚至是多重耐药的超级细菌，给临床治疗带来了极大的困难［10］。而噬菌体作为更早发现的生物制剂，虽然目前的研究还不够成熟，但在面对细菌选择性和针对细菌专一性方面都具有明显的优越性。

4.1 噬菌体杀菌有严格的宿主特异性，不会破坏正常菌群

不同的噬菌体吸附宿主菌的部位是不同的，通常噬菌体的尾端吸附于细菌的表面，有尾噬菌体多以尾丝吸附宿主菌的外膜蛋白，另外，噬菌体能否吸附于菌株主要取决于该特异宿主细胞是否具有噬菌体的结合受点，不同的噬菌体受点位于细胞壁的层次不尽相同，大多数噬菌体如λ噬菌体和P22噬菌体则吸附于细菌的细胞壁组分，例如磷壁酸或多糖（革兰氏阳性菌），脂多糖或蛋白质（革兰氏阴性菌），丝状噬菌体则多吸附于细菌的性菌毛上。噬菌体的穿入是个极其快速的过程，但速率明显受到温度、结构、及其他理化因子的影响。

4.2 噬菌体治疗效果不因细菌耐药性而改变

一些在某些情况下对宿主菌具有较强裂解作用的噬菌体，在某些特定条件下会发生转变，其基因组在进入宿主菌体后不表达溶菌物质，而是整合到宿主菌基因组上，成为溶原性噬菌体，不但不适用于临床治疗，更有可能使宿主菌获得毒力因子。

因为前面几次班级活动都是学生自己策划的，所以，今年的班级生日会，我完全放手让学生操办，我只作为顾问帮助策划者排忧解难。在筹划过程中，小蝶作为主负责人，经常询问我生日会的环节是否合适。

4.3 噬菌体治疗的效率高

根据抗生素的药代动力学，抗生素会进入机体的新陈代谢，并且最终被排出体外，不能集中在感染部位，而噬菌体只在感染部位增殖，并且增殖很快，只需极少量的噬菌体就可以完成大量杀灭细菌的工作。

4.4 噬菌体治疗的副作用少

很少有噬菌体治疗引起严重副反应的报道，偶尔可出现轻微的细菌内毒素反应，但都在可控制的范围之内。Bruttin等［14］让一些健康的志愿者口服纯化后的T4噬菌体制剂，与对照组相比，未见不良的症状，并且足够的证据证明：用噬菌体治疗细菌性感染是很安全的，即使是一些存在免疫缺损的病人服用噬菌体制剂也无异常症状。

4.5 噬菌体制剂研发所需的时间短，成本低

五六十年代，济宁林业遭受很大破坏，森林资源持续减少。随后全国迎来了改革开放，济宁开始大规模推进国土绿化，通过完善造林绿化政策、签订绿化目标责任状、实施工程造林等多种措施，造林绿化稳步推进，森林资源持续增长，截至目前，全市林木绿化覆盖率达到32.21%。

5 噬菌体治疗面临的问题

5.1 引发免疫反应

噬菌体本身具有较强的免疫原性，进入人体后会受到免疫系统攻击。虽然噬菌体在到达感染部位并识别宿主细菌后能迅速产生裂菌作用，但相当数量的噬菌体在循环系统内就已经被固有免疫系统所拦截，并失去活性，这就使静脉注射噬菌体的效率大为降低。马晓丽等人检测了M13噬菌体在血液中的残余活性时间梯度，发现活性噬菌体的数量在注射入血后的数量随时间骤降，5min后剩余约50%，15min时已减少至不到20%。同时该研究组认为，血清中存在的因子可能是导致噬菌体失活的主要因素，且很可能是由IgM介导的补体所引发［15］。

噬菌体基因组中包含有改变细菌致病性的片段，使得溶原性转化的宿主细菌产生一系列表型变化，导致细菌出现毒性或毒性增强，例如白喉棒状杆菌产生白喉毒素，以及C型和D型肉毒梭菌产生肉毒神经毒素。

5.2 鉴别温和噬菌体与烈性噬菌体

噬菌体与抗生素的作用机制完全不同，治疗效果不因细菌耐药性而改变。所以他们能够有效的治疗那些由耐药性细菌所引起的疾病。Carlon［12］指出，细菌对抗生素产生抗性的突变频率是10－6，而对噬菌体产生抗性的突变频率为10－7，联合用药的双突变率降为10－13。并且噬菌体可产生一定程度的变异用以适应宿主菌的变异，传统抗生素则不具备这种优势。Biswas等在2002年曾经报道过，他们运用噬菌体成功地治疗了感染了耐万古霉素屎肠球菌（Vancomycinresistant Enterococcus faecium，VRE）的小鼠［13］。

5.3 药物动力学特征复杂

与传统化学药物相比，噬菌体的药物代谢动力学特征更为复杂。由于噬菌体具有独特的增殖方式及免疫原性，其在体内的代谢情况除与噬菌体种类有关外，还受到细菌数量及代谢状态、人体免疫系统的影响，不同噬菌体具有不同的药物动力学特征，噬菌体的体外生长数据也不能直接运用到体内［16］，因而造成给药时机和剂量不易把握的困难。

5.4 细菌对噬菌体的抗性问题

噬菌体的宿主菌可能会通过突变获得对噬菌体的抗性，这点与细菌对抗生素产生耐药突变相似。虽然这一转变发生的频率远低于耐药突变，但仍然有可能成为噬菌体治疗中的一大困难。

所有真细菌的噬菌体最终都是以裂解宿主细胞的方式来终止营养周期，释放子代病毒。一般噬菌体对细菌的破坏分两步进行［9］：

5.5 噬菌体携带的毒力因子

After the tensile experiment, the relationship of tensile force and distance is shown as Figure 3.

美国作家张纯如不这么看。张纯如26岁那年，在美国斯坦福大学，参加了一次纪念南京大屠杀遇难者的追思会。会上，张纯如被南京大屠杀血腥的历史图片震惊。那些“毫无掩饰的黑白图像：被砍下的头颅、被开膛的腹腔以及裸体的妇女，强奸她们的士兵迫使她们做出各种色情的姿势，她们的脸上则露出了令人难忘的痛苦和羞辱的表情”。这些照片，成为张纯如写作《南京暴行：被遗忘的大屠杀》的直接动因。

5.6 细菌裂解释放内毒素

在噬菌体治疗过程中，不仅体内宿主菌被噬菌体裂解后会释放大量内毒素，而且在噬菌体制剂的制备提纯过程中也很难避免细菌内毒素的混入，使噬菌体制剂在体内的使用遭遇困难。

6 噬菌体治疗的展望

6.1 筛选较宽噬菌谱的噬菌体

噬菌体具有严格的宿主专一性，这使其在细菌分型、检测及特异性杀伤方面具有优势；而过于严格的专一性使得噬菌体仅能对特定型别的宿主菌产生作用，给临床治疗带来困难，因此，需要筛选能够杀伤多种细菌亚型的噬菌体，或通过基因改造获得具有较宽噬菌谱的噬菌体。早期研究中，Merril等人通过向小鼠腹腔内连续注射噬菌体，筛选到能够逃避网状内皮系统诱捕从而在体内长期存活的突变株，即“长期循环”表型噬菌体，从而获得与亲本噬菌体相较更理想的治疗效果［17］。而在现代研究中，利用基因技术解析已知宽噬噬菌体的基因序列，对其他噬菌体进行基因改造以使其获得较宽噬菌谱，将使噬菌体更适合于临床应用。

6.2 优化给药途径

局部病灶直接给药能避免循环系统对噬菌体的免疫作用，从而降低噬菌体被清除的可能性。对于噬菌体难以直接接触的胞内寄生菌，如结核分枝杆菌和鸟分支杆菌，利用耻垢分枝杆菌作为载体向吞噬细胞内传递噬菌体，从而杀灭胞内的鸟分枝杆菌和结核分枝杆菌［17－19］。另外，也有研究利用脂质体作为载体将噬菌体送入胞内从而达到治疗效果［20］。

6.3 筛选强裂解性噬菌体

噬菌体的裂解性越强，治疗宿主菌的感染越有效。通过噬菌斑的大小反复多次筛选，可以获得针对同种宿主菌的强烈解性噬菌体。

6.4 避免噬菌体所携带的毒力因子

一些噬菌体携带有毒素基因，其编码的一些调控因子或酶参与细菌毒性的表达。

6.5 减少裂解导致的内毒素释放量

噬菌体介导的裂解使细菌内毒素大量释放，由此可能引起经过基因修饰的非裂解性噬菌体，如溶菌酶缺陷型噬菌体可以杀死宿主细菌而不使其发生裂解，从而避免内毒素的释放。通过基因修饰改造线状噬菌体，能够产生对细菌致命的蛋白质，但不使细菌裂解，在达到杀菌目的的同时减少内毒素释放［21］。

6.6 建立针对临床病原菌分离株的噬菌体库

由于噬菌体对宿主具有严格的选择性，因此对于任意特定种类的细菌，都需要应对以相应的高敏感性噬菌体，这就需要收集和筛选大量的专一性噬菌体保存，以建立较为完备的噬菌体库。

7 结束语

综上所述，近年来不断开展的噬菌体抗感染治疗实验表明，噬菌体作为新型抗感染药物，具有广阔的发展前景。特别在面对多重耐药细菌感染的治疗上，噬菌体制剂具有明显的优越性。但目前需要进一步研究噬菌体在体内的药物动力学问题，迫切需要解决问题有噬菌体的宽噬性和噬菌体制剂安全性等。希望通过不断地探索实验，使噬菌体的抗感染治疗方法得到不断的完善，同时也使人们在抗感染研究方面取得突破性的进展。

1 Waldor MK，Friedman DI，Adhya SL.Phages their role in bacterial pathologenesis and biotechnology［M］.Washington，DC：ASM Press，2005，423－424.

2 Summers WC.On the origins of the science in Arrowsmith：Paul de Kruif，Felix d′Herelle，and phage［J］.J Hist Med Allied Sci，1991，46（3）：315－332.

3 Summers WC.Bacteriophage therapy［J］.Ann Rev Microbiol，2001，55（10）：437－451.

4 司穉东，何晓青.噬菌体学 ［M］.北京：科学出版社，1996，179－180.

5 O′Flaherty S，Ross RP，Coffey A.Bacteriophage and their lysins for elimination of infectious bacteria［J］.FEMS Microbiol Rev，2009，33（4）：801.

6 Debarbieux L，Leduc D，Maura D，et al.Bacteriophages can treat and prevent Pseudomonas aeruginosa lung infections［J］.J Infect Dis，2010，201（7）：1096－1104.

7 Matsuzaki S，Yasuda M，Nishikawa H，et al.Experimental protection of mice against lethal Staphylococcus aureus infection by novel bacteriophage phi MR11［J］.J Infect Dis，2003，187（4）：613－624.

8 Morello E，Saussereau E，Maura D，et al.Pulmonary bacteriophage therapy on Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis strains：first steps towards treatment and prevention［J］.PLoS One，2011，6（2）：e16963.

9 徐焰.噬菌体溶菌机制研究进展［J］.重庆医学，2003，32（1）：106－108.

10 文细毛，任南，吴安华，等.全国医院感染监控网医院感染病原菌分布及变化趋势［J］.中国感染学杂志，2011，21（2）：350－355.

11 吕欣.噬菌体在细菌性感染治疗中的应用及展望［J］.国外医学病毒学分册，2002，8（6）：190－192.

12 Carlton RM.Phage therapy：past history and future prospect［J］.Arch Immunol Ther Exp，1999，47（5）：267－274.

13 Biswas B，Adhya S，Washart P，et al.Bacteriophage therapy rescues mice bacteremic from a clinical isolate of vancomycin－resistant Enterococcus faecium［J］.Infect Immun，2002，70（1）：204－210.

14 Bruttin A，Brussow H.Human volunteers receiving Escherichia coli phage T4orally：A safety test of phage therapy［J］.Antimicrob Agents Chemother，2005，49（7）：2874－2878.

15 马晓丽，吴庆庆，温龙平.噬菌体在血液中的失活及其机理的初步研究［J］.中国科学技术大学学报，2009，39（1）：90－93.

16 Weld RJ，Butts C，Heinemann JA.Models of phage growth and their applicability to phage therapy［J］.J Theor Biol，2004，227（1）：1－11.

17 Merril CR，Biswas B，Carlton R，et al.Long－circulating bacteriophage as antibacterial agents［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93（8）：3188－3192.

18 Broxmeyer L，Sosnowska D，Miltner E，et al.Killing of Mycobacterium avium and Mycobacterium tuberculosis by a mycobacteriophage delivered by a nonvirulent mycobacterium：a model for phage therapy of intracellular bacterial pathogens［J］.J Infect Dis，2002，186（8）：1155－1160.

19 Danelishvili L，Young LS，Bermudez LE.In vivo efficacy of phage therapy for Mycobacterium avium infection as delivered by a nonvirulent mycobacterium［J］.Microb Drug Resist，2006，12（1）：1－6.

20 黄新，高飞絮，常胜合，等.噬菌体脂质体包被液治疗小鼠耐多药结核的初步研究［J］.中国新药杂志，2008，17（6）：482－485.

21 Hagens S，Habel A，von Ahsen U，et al.Therapy of experimental Pseudomonas infection with a non－replicating genetically modified phage［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48（10）：3817－3822.