洁净室微生物监测容易忽视的两个问题

柴海毅

（上海诺狄生物科技有限公司，上海 201612）

目前国内各制药企业环境监测中微生物的监测方法大多依据GB/T 16293-2010医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法和GB/T 16294-2010医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法进行。以这两个国标来实施监测制药企业洁净室的微生物，对大多数生产普通制剂或API的厂家来说是没有问题的。

但是对于抗生素企业和部分制剂厂家来说，仅仅按照这两个国标推荐的两种培养基大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）和沙氏琼脂培养基（SDA）来监测洁净室的微生物则是不全面的。在抗生素生产企业，其洁净室内不可避免地混杂着一定量的抗生素粉尘，如果没有采取能够消除抗生素粉尘对微生物生存和生长的影响的措施，就采用国标的方法测试该环境中的微生物，得到的监测结果，不可避免的将是一个“假阴性”的结果；同样，部分药物的API对个别微生物也有不同程度的抑制或杀灭作用，要是不消除这类影响微生物生存和生长的环境因素，同样会得到“假阴性”的结果。

现在国内绝大多数制药企业环境监测中微生物取样的培养基是检验员人工制作，培养基灭菌，浇制平板，预培养后剔除污染的平板后置冷藏箱内待用，保存期限一般不超过3周。采用这样的方法进行环境监测微生物的取样，因为无法从根本上保证取样平板的无菌性，得到的监测结果不可避免的是一个“假阳性”的结果。

“假阴性”和“假阳性”两个结果都没有真实的还原洁净室内微生物的实际状况。取样测试的结果与洁净室内微生物实际状况出现了偏差。这样的结果如果发生在A级或B级区，由此产生的众多调查、重复测试等工作量，将会导致大量的经济损失。

“假阴性”和“假阳性”两个结果的产生，就是因为在环境监测微生物取样测试时忽视了这样两个问题，忽视了洁净环境中存在的抑菌成分；忽视了取样平板的无菌性。

1 洁净环境中的抑菌成分的消除

制药企业洁净环境中的抑菌成分主要有这样两大类：①API；②消毒剂残留。

1.1 API主要分为这样两部分：抗生素和部分API

消除抗生素粉尘的残留，采用的方法就是降解取样时落在培养基平板上的抗生素，在取样平板的培养基内添加一定量的酶，对于β-内酰胺类抗生素，添加β-内酰胺酶 （即青霉素酶）；对于头孢类抗生素，则添加头孢菌素酶。

而API的消除，则主要依据：“中国药典”2010年版 附录109页 附录XI J 表1：“常见干扰物中和剂或灭活方法” 中所对应的中和或灭活方法，还有一个方法就是借鉴相关产品微生物检验方法验证中所采取的中和或灭活方法来消除API的影响。

1.2 消毒剂残留

制药企业洁净环境每天都在使用消毒剂，怎样确定残留的消毒剂没有影响微生物的生长？选择什么样的培养基可以最大限度的衡量洁净室表面的微生物水平？理论知识告诉我们，卵磷脂、吐温-80组合后能够消除季胺类化合物（苯扎溴铵、苯扎氯铵等）消毒剂的影响；卵磷脂、吐温-80和L-组氨酸组合后能够消除醛类（甲醛、戊二铨等）和酚类（苯酚、间苯二酚等）消毒剂的影响；硫代硫酸钠能够消除卤素类消毒剂（碘伏、碘酒等）的影响等。

现在，国外制药企业环境微生物监测时，用于洁净室表面取样的培养基大多为大豆酪蛋白+卵磷脂+吐温-80琼脂培养基（即TSAWLP）。选择这样的培养基就可以有效的降解可能残留在洁净室表面的消毒剂（主要是季胺类化合物消毒剂）的残留。

2 取样平板的无菌性

《中国药典》2010年版中对用于环境监测的培养基平板有明确的要求。用于环境监测的培养基须特别防护，最好要双层包装和终端灭菌，如果不能采用终端灭菌的培养基，那么，在使用前应进行100%的预培养以防止外来的污染物带到环境中以避免出现假阳性的结果[1]。由此可见，在法规层面，对于制药企业洁净室环境中微生物测试的培养基提出了严格要求。要求在洁净室取样时采用无菌的预制培养基平板（即Ready to- use Culture Media Plate）取样。

事实上，国外众多的制药企业用于洁净环境测试的培养基平板，包括：浮游菌、沉降菌取样的90mm普通平板和表面取样的55mm接触平板都是无菌的预制平板培养基。《中国药典》2010年版中对用于环境监测的培养基的要求就是出自USP〈1117〉MICROBIOLOGICAL BEST LABORATORY PRACTICES 章节[2]。

对比中国药典和USP两部药典在环境监测培养基的具体要求，USP还特别强调了预培养之后必须要进行的促生长试验（即Growth Promotion Testing），这里也凸显了USP在强调避免微生物测试结果“假阳性”的同时，更加关注的是微生物测试结果的“假阴性”。现代微生物检测领域，“假阴性”远比“假阳性”要可怕，制药企业洁净环境中微生物的检测，使用无菌预制平板培养基，不仅完全杜绝了测试结果的“假阳性”，同时也消除了“假阴性”的可能。也符合了中国GMP规范2010年版中大力提倡的风险管理的理念。

3 制药企业洁净环境微生物监测的解决方案

针对制药企业洁净环境微生物监测中忽视的问题，在设计一个洁净室的微生物监测方案时，应该着力避免这两个问题。在培养基中添加β-内酰胺酶或头孢菌素酶是一定要做验证的，就是要验证所添加酶或中和剂的种类和剂量能够完全降解掉环境中的抑菌因素，从而真实还原本企业生产环境中可能存在的微生物的真实水平。避免环境监测微生物“假阳性”或“假阴性”结果，另一行之有效方法就是采用无菌预制培养基平板（Ready to- use Culture Media Plate）取样。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国中国药典：2010年版二部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录XIX Q.

[2] 美国药典委员USP 33版〈1117〉MICROBIOLOGICAL BEST LABORATORY PRACTICES.