钙网蛋白与抗肿瘤免疫的相关性研究新进展

熊辉强 综述，李 黎，张少容审校

（南昌大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科，南昌 330006）

有研究发现，多种肿瘤细胞表面携带了自我毁灭的种子——钙网蛋白（calreticulin，CRT），其可发送信号招募吞噬细胞吞噬并消化这些肿瘤细胞，达到彻底清除肿瘤细胞的功效。CRT可作为某些肿瘤细胞表面一种有效的促吞噬信号，通过结合吞噬细胞表面的低密度脂蛋白－相关蛋白受体（lowdensity lipoprotein－related protein，LRP）使肿瘤细胞被吞噬，引起机体的抗肿瘤免疫反应［1］。CRT具有多种生物学功能，其表达调控机制复杂，在抗肿瘤免疫过程中发挥重要作用，有望成为抗肿瘤免疫治疗新途径。现将CRT生物学功能、表达、调控及其与抗肿瘤免疫的相关性研究新进展作一综述。

1 CRT的生物学功能及其表达

CRT是一种相对分子质量为4.6×104DaCa2＋结合蛋白，主要位于非肌细胞粗面内质网和肌质网中，由人19号染色体上单一基因编码，包含9个外显子，具有高度的进化保守性［2］。CRT具有多种功能，参与伴侣分子活性及细胞内Ca2＋环境平衡的调节，细胞间黏附信号的调控，内质网中折叠和低聚反应过程中黏蛋白的合成，以及抑制血管生成和肿瘤细胞生长［3－4］。此外，CRT在主要组织相容性复合体I（major histocompatibility complex I，MHC－I）的组合、类固醇介导的基因的调节以及Zn2＋的结合和储存中起重要作用［5］。细胞核中的CRT能调节核蛋白迁移和影响信号经由核甾体激素受体和整联蛋白［6］。当用蒽环类抗生素、奥沙利铂、放射治疗及缺氧等处理，细胞表面的CRT暴露，并成为一种“来吃我”信号，招募树突状细胞（dendritic cells，DCs）和巨噬细胞，导致免疫反应［7－8］。CRT 还与肿瘤的发生有关，通过增加细胞与细胞间、细胞与基质间的黏附能力［9］或者减少 MHC－I类抗原提呈发挥作用［10］。

CRT的表达已经在多种肿瘤中被发现，例如黑色素瘤、肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌及乳腺癌［11－14］等。Chao等［15］研究表明，CRT主要表达于恶性肿瘤细胞和凋亡细胞的表面，前者主要包括血液系统恶性肿瘤中的急性髓细胞白血病（acute myelocytic leukemia，AML）、急性淋巴细胞性白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）、慢性髓细胞白血病（chronic myelognous leukemia，CML）和非霍奇金淋巴瘤（non－Hodgkin’s lymphoma，NHL），以及实体瘤中的恶性胶质瘤、膀胱癌和卵巢癌等，但是在对应的正常细胞中却很少表达。以往的研究还表明CRT亦存在于有活性的外周血T细胞和循环中的中性粒细胞［16］。

2 CRT表达的调控机制

CRT正常位于细胞的内质网腔，其在细胞中发挥促吞噬信号功能需要经过系列的途径迁移至胞膜，并与ERp57以分子络合物的形式共同表达于细胞膜表面发挥作用。CRT暴露迁移途径复杂，涉及的调控机制：内质网（endoplasmic reticu－lum，ER）应激性原理、细胞凋亡机制（caspase－8及其底物BAP31、Bax、Bak）、蛋白从ER至高尔基体的转运，以及 N－甲基马来酞胺敏感因子附着蛋白受体（soluble NSF attachment protein receptors，SNAREs）相关的胞吐作用等。

2.1 ER应激性原理 在Kepp等［17］的研究中，用蒽环类抗生素、奥沙利铂（抗肿瘤药）或者电离照射治疗一段时间的鼠CT26细胞、人类HCT－16结肠癌细胞，以及人类Hela颈部癌细胞和鼠胚胎性成纤维细胞，发现CRT能够暴露于这些细胞的表面，该作用是伴随ER超微结构的破坏以及ER应激反应信号的产生，使内质网固定激酶PERK激活，真核起始因子（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）则变成了磷酸化的丝氨酸－51，并转化成一种鸟嘌呤核苷酸转换因子eIF2β的抑制剂，从而影响CRT蛋白合成。同样地，敲除PERK也能废除CRT暴露。因此，CRT的暴露需要PERK介导的eIF2α磷酸化作用。而Novoa等［18］研究表明，ER应激还能产生一种由2个亚单位构成的GADD34抑制剂，通过与蛋白磷酸酶－1（PP1）的相互作用来介导eIF2α磷酸化过程，影响CRT的暴露途径。

2.2 细胞凋亡机制 有研究发现，细胞表面CRT的表达能被一般的半胱天冬酶（caspase）抑制剂所抑制，例如化学合成的假底物Z－VAD－fmk或者杆状病毒编码的p35蛋白［19］。相应地，敲除PERK能废除由蒽环类抗生素诱导的caspase－8的蛋白水解成熟过程。敲除caspase－8基因（而不是caspase－3，7，12）能废除CRT的暴露。然而在caspase－8－／－MEFs显示出正常的PERK介导的eIF2α磷酸化，表明PERK位于caspase－8的上游区。caspase－8需要降解其底物BAP31发挥作用，BAP31是一种 Bcl－2结合蛋白［20］。当用无裂解的 D164A／D238ABAP31突变体转染Hela癌细胞后丢失了CRT迁移能力，敲除BAP31类似于废除CRT暴露。Bcl－2是细胞凋亡的一个显著性的抑制剂，能阻碍促吞噬因子的Bax和Bak的活性［21］。在MEFs中敲除Bax或者Bak中的任何一个，或者在Hela和CT26细胞中敲除Bax、Bak蛋白均能废除CRT的暴露。由此可见，caspase－8及其裂解底物BAP31、Bax、Bak都是CRT暴露所必须的。

2.3 蛋白的转运与胞吐作用 CRT的暴露需经过ER至高尔基体转运的过程，CRT蛋白以小囊泡形式从高尔基体发出，与细胞膜融合，并以SNAREs依赖的胞吐方式分泌。布雷菲德菌素A（brefeldin A），一种顺行蛋白从ER至高尔基体转运的抑制剂，能阻断由蒽环类抗生素诱导的CRT暴露，敲除SNAREs同样能抑制CRT暴露。表明蛋白的转运过程和胞吐作用对于CRT释放起重要作用。

2.4 ERp57 ERp57是一种固着的二硫化物异构酶，能在ER内相互干扰CRT，共同转移CRT至细胞表面，应对免疫原性的细胞死亡诱导。敲除了ERp57能完全废除CRT暴露，反之亦然，敲除CRT也能抑制ERp57暴露。用特异性ERp57逆转录RNA干扰的肿瘤细胞可减少ERp57表达，再用蒽环类药物处理只表现正常的凋亡，ERp57低表达的肿瘤细胞不能引起CRT的移位。表明CRT与ERp57的相互作用是共迁移到细胞表面所必需的。Obeid［22］研究显示，CRT的表达受到ERp57表达的控制，敲掉ERp57可抑制CRT的表达并被树突状细胞吞噬，从而消除了免疫原性，敲掉CRT或缺乏CRT可消除ERp57的表达，给予重组ERp57并不能恢复肿瘤细胞的免疫原性（与v重组CRT不同），ERp57通过控制CRT的表达来控制肿瘤细胞的免疫原性。

3 CRT与抗肿瘤免疫

有效地抗肿瘤治疗不单是杀死肿瘤细胞，更重要的是建立抗肿瘤免疫反应。肿瘤细胞表面CRT的表达能招募DCs和吞噬细胞，导致机体的抗肿瘤免疫反应。Xu等［23］研究发现，CRT不仅能够结合E7有效地促进DCs提呈E7抗原、诱导抗原特异性CD8－T细胞，还能促使白细胞介素（IL）－2、IFN－γ分泌，进而活化吞噬细胞、自然杀伤（NK）细胞，促使CTL增殖及抗肿瘤免疫作用。肿瘤细胞可以通过多种机制逃避免疫攻击而抵抗机体的免疫清除。最近有研究表明，肿瘤细胞通过下调促吞噬信号的CRT表达是细胞逃避吞噬反应的另外一种机制，通过这种机制肿瘤细胞可以逃避免疫监视。若能对某些因低水平表达CRT引起的肿瘤免疫逃避反应增加其细胞表面CRT的表达则能重新引起机体的抗肿瘤免疫，使肿瘤细胞被清除。Panaretakis等［24］研究发现，用蒽环类抗生素——米托蒽醌（MTX）治疗高水平表达CRT／ERp57的鼠CT26癌细胞移植瘤时其能被治愈，而移植低水平表达CRT／ERp57的CT26癌细胞的小鼠移植瘤却未能被治愈。对于后者，当其瘤体内注射重组体CRT蛋白时又能使小鼠被治愈。因为注射重组体CRT蛋白后，其能吸附至肿瘤细胞表面，相当于增加了肿瘤细胞表面CRT的表达。为了证明细胞表面增加CRT表达能否促使吞噬作用进行了体外吞噬实验，在培养的骨髓细胞（normal bone marrow，NBM）中添加外源性重组体CRT蛋白，与对照组比较，用外源性CRT培养的NBM能够促使巨噬细胞的吞噬作用。这些结果表明机体的抗肿瘤免疫功能的发挥需要细胞表面CRT的存在。

Chao等［15］研究表明，多数肿瘤细胞“促吞噬信号”CRT的表达常伴有“抗吞噬信号”CD47的表达，以此来防护CRT介导的吞噬作用。当CRT－阻断肽阻断靶细胞表面CRT与吞噬细胞表面的受体LRP间的相互作用，吞噬活性被完全废除，从而引起肿瘤的免疫逃避。同样地，若能下调“抗吞噬信号”CD47的表达水平，此时相当于上调了CRT的水平，则同样能引起吞噬细胞对肿瘤的吞噬作用。为了证明这一假说，他们用慢病毒－shRNAs敲除Raji细胞（一种Burkitts NHL细胞系）中CD47基因的表达，细胞表面CRT的表达没有受shRNA介导的CD47基因敲除的影响，当其置于人类吞噬细胞中一起培养，与对照组比较，Raji细胞能大量被人类吞噬细胞吞噬。当用抗－CD47单克隆抗体结合肿瘤细胞表面的CD47分子，同样能使肿瘤细胞中的抗吞噬信号（CD47）被抑制，暴露出促吞噬信号（CRT），促使了吞噬细胞的吞噬作用。从上述研究可见，肿瘤细胞表面CRT和CD47的平衡表达，对机体的抗肿瘤免疫起重要的作用。CRT作为多种人类癌症组织中的主要促吞噬信号，为用重组体CRT及沉默CD47基因对肿瘤的靶向治疗提供依据。

Peng等［25］研究表明，结肠癌中CRT的表达和CD45RO＋T细胞的浸润密切相关，与CD3＋T细胞的浸润及患者的其他参数（年龄、性别、肿瘤位置）无相关性。CD45RO＋T细胞为一种记忆性T细胞，其表面黏附分子表达强，能直接向抗原部位移动，当再次抗原刺激时，即刻发生强烈的免疫反应［26］。CD45RO＋T细胞在结直肠癌组织中的浸润，能减缓肿瘤的进展［27］。CRT的抗肿瘤免疫功能可能与刺激CD45RO＋T细胞的增殖、浸润有关。尚需更多的研究进一步证实并发现其相关作用机制。

4 展 望

肿瘤发生的一个重要因素就是突变的肿瘤细胞能够下调一些分子的表达来逃避免疫反应，而这些分子在细胞识别和吞噬过程中起重要的作用［28］。期望通过改变细胞表面相关分子的表达来恢复或者刺激机体的免疫反应，以此来完成一种有效的肿瘤预防和治疗。CRT作为某些恶性肿瘤组织中的主要“促吞噬信号”，其在肿瘤细胞中的移位暴露引发了免疫反应，为抗肿瘤传统治疗方法联合免疫治疗提供新的契机。CRT的促吞噬作用能被细胞表面“抗吞噬信号”的CD47分子所抵抗，敲除CD47基因或者用抗－CD47单克隆抗体疗法同样可以达到治疗效果，表明肿瘤免疫过程中促吞噬和抗吞噬信号平衡表达的重要性。其他恶性肿瘤组织中是否均存在CRT的表达，其如何与CD47共同作用于肿瘤的发生、发展，以及其相关作用机制，这些都亟待进一步的深入研究。

［1］ Gardai SJ，McPhillips KA，Frasch SC，et al.Cell－surface calreticulin initiates clearance of viable or apoptotic cells through trans－activation of LRP on the phagocyte［J］.Cell，2005，123（2）：321－334.

［2］ Ni M，Lee AS.ER chaperones in mammalian development and human diseases［J］.FEBS Lett，2007，581（19）：3641－3651.

［3］ Garg AD，Nowis D，Golab J，et al.Immunogenic cell death，DAMPs and anticancer therapeutics：an emerging amalgamation［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1805（1）：53－71.

［4］ Villagomez M，Szabo E，Podcheko A，et al.Calreticulin and focal－contact－dependent adhesion［J］.Biochem Cell Biol，2009，87（4）：545－556.

［5］ Solheim JC，Class I.MHC molecules：assembly and antigen presentation［J］.Immunol Rev，1999，172：11－19.

［6］ Mesaeli N，Phillipson C.Impaired p53expression，function，and nuclear localization in calreticulin－deficient cells［J］.Mol Biol Cell，2004，15（4）：1862－1870.

［7］ Tesniere A，Schlemmer F，Boige V，et al.Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin［J］.Oncogene，2010，29（4）：482－491.

［8］ Panaretakis T，Kepp O，Brockmeier U，et al.Mechanisms of pre－apoptotic calreticulin exposure in immunogenic cell death［J］.EMBO J，2009，28（5）：578－590.

［9］ Alur M，Nguyen MM，Eggener SE，et al.Suppressive roles of calreticulin in prostate cancer growth and metastasis［J］.Ame J Pathol，2009，175（2）：882－890.

［10］Howe C，Garstka M，Al－Balushi M，et al.Calreticulin－de－pendent recycling in the early secretory pathway mediates optimal peptide loading of MHC class I molecules［J］.EMBO J，2009，28（23）：3730－3744.

［11］Kageyama S，Isono T，Matsuda S，et al.Urinary calreticulin in the diagnosis of bladder urothelial carcinoma［J］.Int J Urol，2009，16（5）：481－486.

［12］Seliger B，Stoehr R，Handke D，et al.Association of HLA class I antigen abnormalities with disease progression and early recurrence in prostate cancer［J］.Cancer Immunol Immunother，2010，59（4）：529－540.

［13］Eric，Juranic Z，Milovanovic Z，et al.Effects of humoral immunity and calreticulin overexpression on postoperative course in breast cancer［J］.Pathol Oncol Res，2009，15（1）：89－90.

［14］Bergner A，Kellner J，Tufman A，et al.Endoplasmic reti culum Ca2＋－homeostasis is altered in small and non－small cell lung cancer cell lines［J］.J Exp Clin Cancer Res，2009，28（1）：25－31.

［15］Chao MP，Jaiswal S，Weissman－Tsukamoto R，et al.Calreticulin is the dominant pro－phagocytic signal on multiple human cancers and is counterbalanced by CD47［J］.Sci Transl Med，2010，2（63）：1－9.

［16］Ghiran I，Klickstein LB，Nicholson－Weller A.Calreticulin is at the surface of circulating neutrophils and uses CD59 as an adaptor molecule［J］.J Biol Chem，2003，278（23）：21024－21031.

［17］Kepp O，Senovilla L，Galluzzi L，et al.Viral subversion of immunogenic cell death［J］.Cell Cycle，2009，8（6）：860－869.

［18］Novoa I，Zeng H，Harding HP，et al.Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34－mediated dephosphorylation of eIF2alpha［J］.J Cell Biol，2001，153（5）：1011－1022.

［19］Obeid M，Tesniere A，Ghiringhelli F，et al.Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death［J］.Nat Med，2007，13（1）：54－61.

［20］Nq FW，Nquyen M，Kwan T，et al.p28Bap31，a Bcl－2／Bcl－XL－and procaspase－8－associated protein in the endoplasmic reticulum［J］.J Cell Biol 1997，139（2）：327－338.

［21］Kroemer G，Galluzzi L，Brenner C.Mitochondrial membrane permeabilization in cell death［J］.Physiol Rev，2007，87（1）：99－163.

［22］Obeid M.ERp57membrane translocation dictates the immunogenicity of tumor cell death by controlling the membrane translocation of calreiculin［J］.J Immunol，2008，181（4）：2533－2543.

［23］Xu Y，Cheng H，Zhao KJ，et al.HPV DNA vaccines expressing recombinant CRT／HPV 6bE7fusion protein inhibit tumor growth and angiogenic activity［J］.Bing Du Xue Bao，2007，23（6）：466－470.

［24］Panaretakis T，Joza N，Modjtahedi N，et al.The co－translocation of ERp57and calreticulin determines the immunogenicity of cell death［J］.Cell Death Differ，2008，15（9）：1499－1509.

［25］Peng RQ，Chen YB，Ding Y，et al.Expression of calreticulin is associated with infltration of T－cells in stage ⅢB colon cancer［J］.World J Gastroenterol，2010，16（19）：2428－2434.

［26］肖刚，赵刚，许晓东，等.结肠癌患者外周血中CD4＋CD45RA＋T和CD4＋CD45RO＋T细胞的变化及其意义［J］.中华肿瘤杂志，2003，25（4）：362－364.

［27］Pagès F，Kirilovsky A，Mlecnik B，et al.In situ cytotoxic and memory T cells predict outcome in patients with early－stage colorectal cancer［J］.J Clin Oncol，2009，27（35）：5944－5951.

［28］Kepp O，Tesniere A，Schlemmer F，et al.Immunogenic cell death modalities and their impact on cancer treatment［J］.Apoptosis，2009，14（4）：364－375.