黄瓜性别决定的分子机理研究进展

赵志刚，柳美玲

（1 空军司令部 南苑农副业基地，北京 100076; 2 中国农业大学 农学与生物技术学院，北京 100193)

黄瓜(Cucumis sativus L)是世界十大蔬菜之一，是我国第一大保护地蔬菜作物，是农村致富和农民增收的重要产业。根据联合国粮食及农业组织统计数据，2009年我国黄瓜栽培面积已达175.3万公顷，总产量为2324.7万吨，分别占我国蔬菜总播种面积和总产量的19.3%和15.6%，占同期全球黄瓜总量的64.9%和59.1%（FAOSTAT, 2009），栽培面积和总产量均占世界首位。但是，相对于世界发达国家如荷兰、法国，我国黄瓜的单位面积产量低（我国黄瓜单位面积产量为13.3hg/hm，低于世界平均水平14.6万hg/hm），产品品质整体水平差，严重影响了黄瓜的出口量和农民的收入。

新品种的培育是实现农作物高产优质的主要原动力，而全雌系或强雌系品种是黄瓜优势育种的重要途经。黄瓜，由于其丰富多样的性型表现而成为研究高等植物性别决定的模式植物[1]，黄瓜的性型包括雌雄异花同株(Monoecious)、纯雌株(Gynoecious)、两性株(Hermaphroditic)、雄花两性花同株(Andromonoecious)以及三性株(Trimonoecious)[2]。其中，雌雄异花同株是最普遍的性别表达类型。在雌雄异花同株中，沿着主茎的花的发育可以分为三个阶段:第一个阶段是雄花形成阶段，第二个阶段是雌花和雄花均形成的混合阶段，第三个阶段是雌花形成阶段。

本文综述了黄瓜性别决定的最新分子机理研究进展，旨在为培育高产优质的黄瓜雌性系品种提供理论基础。

1 黄瓜的花

黄瓜的花包括单性花和两性花，但是在发育早期，所有的花原基都包含四个轮生体，分别是萼片、花瓣、雄蕊和心皮，而单性花（雌花或雄花）的形成来自于黄瓜花发育过程中雄蕊或心皮的选择性败育[3]。有研究发现雄蕊的败育主要发生在花药原基，这种败育与DNA的损伤密切相关[4]。通过对黄瓜花的同源突变体的研究表明，雄蕊或心皮发育的抑制依赖于轮生体的位置，而不是花器官的性别属性[3]。在雄花中，心皮原基的败育是先于花芽发育过程的第六阶段子房的分化，而在雌花中，花药和花丝的败育发生在花芽发育第七阶段花药DNA降解之后[4]。

2 影响黄瓜性别的因素

黄瓜的性别决定是一个复杂的过程，受多种的因素影响，包括基因型、植物激素以及外界环境条件。

2.1 影响黄瓜性别的基因

黄瓜的性别主要受三个基因调控：F、M和A。F基因是半显性的，其作用是加强雌性，促进雌性较早发育，并使雌花向低节位发育[5]。M基因抑制雄花的发育，但不影响花在植株上的分布和排列。A基因抑制雌花发育，增强雄性，对F基因有上位效应[6]。F、M和A三个影响黄瓜性别决定的主效基因相互作用产生各种不同的性别表型：全雌花基因型为F-M-AA/Aa/aa，雌雄异花同株为ffM-A-，雄花两性花为mmffA-，两性花为F-mmAA/Aa/aa，纯雄株为ff MM/Mm/mm aa。

氨基环丙羧酸(ACC)合酶在黄瓜花芽分化过程中起到信号转导作用[7]，乙烯被认为是黄瓜的“性激素”，它既促进雌性的表达，也同时抑制雄性的表达。乙烯的合成途径为甲硫氨酸-S腺苷甲硫氨酸(SAM或AdoMet)-ACC-乙烯[8]。其中，ACC合酶催化SAM形成ACC，是乙烯合成的主要限速酶，所以ACC合酶基因家族对黄瓜性型分化具有重要作用。

研究表明，F基因即Cs-ACS1G，它被认为是由ACC合酶基因CsACS1新产生拷贝的上游序列与另外一个基因BCAT的部分区域重组而成[9]，从而改变基因的启动子区域。目前，Cs-ACS1和Cs-ACS1G的启动子区域已经被克隆[10]，这两个序列都包含典型的启动子顺式作用元件比如TATA盒子和CAAT盒子，另外，还包含一个生长素诱导的TGTCT元件。Cs-ACS1G是由Trebitsh等首先在黄瓜雌性系中发现的，而在邻近的等基因的雌雄同株系中却没有[11,12]。2005年，陈惠明[6]等以不同性型的黄瓜为研究材料，通过针对CsACS1G基因设计的特异SCAR引物分析了CsACS1G基因与F基因以及雌性性状之间的关系，并对CsACS1G进行了定位结果也表明了Cs-ACS1G与Cs-ACS1基因的差异主要在启动子区。利用北京蔬菜研究中心构建的黄瓜连锁图谱，成功将Cs-ACS1G基因特异的SCAR标记定位在第10连锁群上。随后，程立宝等人克隆了Cs-ACS1G基因并对其进行了时空表达研究，表明Cs-ACS1G基因在黄瓜不同组织表达状况不同，在根尖和茎尖生长点表达强，而在果实和腋芽中表达则很弱。因此，黄瓜Cs-ACS1G基因的时空表达模式存在差异[13]。

2009年，Li等利用图位克隆的方法分离了黄瓜的M基因[14]。M基因编码乙烯合成途径中的一个关键酶CsACS2，该酶关键氨基酸的突变可导致两性花变成单性花[14]，与甜瓜中抑制雄花发育的a基因类似[15]。有研究表明乙烯通过影响M基因的产物从而抑制黄瓜中雄蕊的发育[7]。CsACS2基因的表达主要集中在发育的雌蕊原基基部，且持续时间较长。另外，Cs-ACS2基因在雌雄同株和纯雌株的茎尖以及黄瓜子房中表达。

陈惠明等鉴定了两个新的黄瓜性别表达基因，分别命名为Mod-F1（不完全显性）和mod-F2（隐性基因），二者均与F和M基因独立遗传，能够增强黄瓜植株的雌性性状的表达[16]。

目前，在黄瓜中，另外两个ACC合酶基因CS-ACS3和CS-ACS4也已经被克隆[17]。研究表明CS-ACS3基因受IAA诱导[6]，与Trebitsh[18]等报道的CS-ACS1和CS-ACS1G高度同源，可能是CS-ACS1G基因。但是，Kamachi等人发现，CS-ACS3基因表达量并不随着黄瓜性别类型的改变而改变，认为CS-ACS3基因与黄瓜的性别关系不大[2]。CS-ACS4基因的表达情况在两性系和雄全同株系中没有明显的不同，但是在短日照（8h）比在长日照(16h)下表达量高。

ACC氧化酶是乙烯合成中的最后一个关键酶，ACC氧化酶基因CS-ACO1、CS-ACO2和CS-ACO3也被克隆，Kahana等通过RFLP分析纯雌株与雌雄同株杂交的F2分离群体的结果表明F位点(locus)与Cs-ACO2之间的连锁距离为8.7cM，同时发现CS-ACO2和CS-ACO3的表达与黄瓜的雌性表达呈负相关[19]。有研究表明，被AP3启动子驱动的黄瓜基因Cs-ACO2在拟南芥中的过表达可以通过诱导染色质的浓缩使拟南芥的雄蕊败育，与黄瓜雌花发育过程中雄蕊的败育是一致的[4,20]。乙烯受体基因也是乙烯信号传递途径中的关键基因，黄瓜乙烯受体基因CS-ETR1、CS-ETR2、CS-ERS、CS-CTR、CS-EIN3、CS-EIL1、CS-EIL2、CS-ERF1、CS-EREBP等已被相继克隆。研究表明，M/m基因或者其产物能够通过控制CS-ETR2、CS-ERS等乙烯受体的表达而控制乙烯信号传递，进而实现对黄瓜性别的调控。如雌雄同株和纯雌株茎尖中CS-ETR2和CS-ERS基因表达明显受乙烯的诱导，而在雄全同株中受乙烯诱导的效果不明显。同时，纯雌株中CS-ETR2和CS-ERS的高表达量可能与纯雌株内源乙烯含量高有关，并在黄瓜雌性发育中起作用。

另外，黄瓜的性别发育还受MADS-box[21]基因家族调控，MADS-box基因是一类广泛存在于植物中序列特异的同源异型基因。它所编码的MADS-box蛋白质是一种转录因子，在生物体中通过调节其他基因的表达来发挥其调控作用。上个世纪九十年代Coen和Meye．rowitz提出的ABC模型认为：A、B、C这三类调控花器官特征的基因（其中绝大多数都是MADS-box基因）以联合或单独的方式来控制花器官的特征；A基因单独控制萼片，A基因和B基因共同调控花瓣，B基因和C基因共同调控雄蕊，C基因单独调控心皮，其中A基因和C基因的作用相互抑制。MADS-box基因家族包括黄瓜的AGAMOUS基因(CAG1,CAG2和CAG3)，CUCUMBER MADS1(CUM1)和CUM26，它们的基因表达随着花的发育而出现阶段性及组织表达特异性变化, 但不受外源赤霉素和乙烯的影响。ERAF17也是一个MADS-box基因[22]，但它在雌雄同株和全雌株中的转录时期和水平与乙烯利诱导雌花发育是一致的，因此，ERA F17可能介导乙烯诱导的雌花发育过程。

最近，Gu等人发现的CsCaN基因，具有乙烯诱导性和钙依赖性，它在雌花发育的过程中参与了花药原基特异性的DNA损伤，也与黄瓜的性别决定有关[23]。

2010年，Wu等人利用黄瓜的近等基因系材料全雌突变体Csg-G和两性系Csg-M分离出了性别决定的有关基因，结果在突变体中发现了600个下调基因和143个上调基因[24]。并且，其中一些基因的表达与全雌突变体的组织部位以及花的发育阶段有关。他们的研究表明了两个方面的内容：第一，差异表达的基因参与了植物激素信号传递途经，比如ACS、Asr1、CsIAA2、CS-AUX1和TLP，暗示着植物激素以及它们的相互作用在黄瓜性别决定中起着关键作用；第二，一些转录因子的调节，比如EREBP-9，可能也参与了黄瓜性别决定的过程。

2.2 植物激素与黄瓜性别的关系

除了性别决定的基因，植物激素也参与了黄瓜性别决定的过程。赤霉素和乙烯以及他们的抑制剂的施用能够改变植物的基因型，赤霉素的作用主要是促进雄性，而乙烯的作用主要是促进雌性。通过对两性系和雄全同株系的黄瓜处理不同组合的赤霉素和乙烯利，Yin和Quinn指出乙烯是主要的黄瓜性别决定的因素，而赤霉素可能是作为内源乙烯产生的一个抑制因子[25]。这些发现让他们提出了一个性别决定产生的模型：乙烯既能促进雌性又能抑制雄性。这个模型的基本内容是，F基因应该能够编码一种物质，这种物质可以决定内源乙烯在植株上的分布以及生成量，从而作用于植物体促进雌性，而M基因也应该能编码一种对乙烯敏感的雄性受体因子，这种物质能够感知到乙烯信号而抑制雄蕊的发育。

乙烯被称为是植物的“性激素”，其它激素生长素和油菜素内酯，被认为是通过直接或间接影响乙烯的合成或信号传递，来实现对植物性别分化的调控[26,27]。

2.3 环境条件与黄瓜的性别决定

环境因素也影响黄瓜的性别分化，如短日照、低温可以促进雌花产生，而长日照、高温可以促进雄花的产生[28]。

3 存在的问题及展望

在农民生产栽培中，黄瓜经常出现低雌花率甚至无雌花不能坐果，严重影响黄瓜产量，因此培育稳定的强雌或全雌性品种至关重要。然而至今除少数已克隆的性别分化基因外，精确的黄瓜性别决定机制并不清楚，这制约了通过基因工程手段培育优质高产的黄瓜。

从研究方法上看，黄瓜的性别决定研究主要通过同源比对克隆相关基因[13]，如乙烯合成和信号传递途径基因，然后看其表达时间与部位；或通过分子标记法[29-32]，寻找雌性系特异的基因表达，如11-1000。在基因表达水平上，Guo[33]等人利用454测序技术比较了雌性系WI1983G 和两性系WI1983H花芽的转录组表达情况，并发现了214个基因有明显的表达差异。但是，目前黄瓜的性别决定研究从取材和技术手段上都存在很大的局限性。例如，大多性别决定研究以整个植株或花器官为材料，它是大量的生长、发育等下游基因累积作用后的最终结果，一定程度上忽视了对性别决定调控起关键作用的上游基因研究。并且，实验所用的差显法和454测序技术，数据量和灵敏度都比较有限。

鉴于此，今后的研究方向可以利用新兴的精确度和灵敏度都较高的技术比如激光捕获显微切割技术(Laser Microdissection)取样[34,35]，实验材料采用黄瓜不同发育时期的幼嫩的花分生组织或者顶端分生组织[36,37]，寻找并克隆性别决定的上游基因，从分子发育学的角度，研究性别决定的分子机理，为培育高产优质的黄瓜雌性系品种提供理论基础。

另外，虽然黄瓜基因组[38]已经公布，但是有关黄瓜转录组方面的信息仍然缺乏，今后可以从特定组织部位的转录组水平研究黄瓜的性别决定机制。

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