环棱螺抗氧化系统对五氯酚钠毒性暴露的响应研究

范智权，侯建军，夏晓芬，梅芳芳，王元川，李杰东

（湖北师范学院 生命科学学院，湖北 黄石 435002）

五氯酚钠为淡黄色或白色粉末，具有良好的水溶性，在自然界中降解缓慢，并可富集于底泥中，长期使用可造成环境污染和生物蓄积。其污染环境后，可通过食物链或其他途径进入生物体内，从而对人、畜等生物体造成毒害：大剂量PCP-Na进入生物体内，可引起急性中毒甚至死亡；小剂量PCP-Na则具有潜在的遗传毒性[1,2]。其作用机制主要是干扰生物代谢过程中的氧化磷酸化[3,4]。

环棱螺栖息于淤泥底质的水体中，活动能力较弱，对污染避让能力较差，水体环境质量的好坏对其生长和繁殖有着重要影响。因此，环棱螺可作为水污染的指示生物[5]。环棱螺的上述生物标志物能够解释污染物五氯酚钠在水环境中对其进行毒性胁迫作用的机理，从而可用于评估水环境中污染物的生态风险。本实验以PCP-Na为目标毒性物质，用生物标志物法来研究PCP-Na对环棱螺的毒理效应。

1 材料与方法

1.1 材料

环棱螺采自于湖北省黄石市磁湖，质量2±0.2g，螺高16.77～21.70mm，螺宽11.75～13.03mm。实验前选择健康的环棱螺放在水箱中适应和驯养一个星期。驯养期间，实验用水为曝气3d 的自来水，每日换水一次，其它饲养环境条件是：pH 6.4，饲养温度16～25 ℃；急性毒理实验前1天停止喂食，实验期间不喂食[5]。

1.2 急性毒理实验[6]

首先进行预实验，使用不同浓度的五氯酚钠溶液（浓度为0.1～1.6mg·L-1）在30cm×20cm×8cm的水箱进行培养，培养体积为2L，每组放入环棱螺6只，遮光，观察环棱螺的活动，记录其死亡情况，以确定最大耐受浓度(LC0)和绝对致死浓度(LC100)。

根据预实验结果，在急性毒理实验时，设定浓度为0.1～0.8mg·L-1的7个梯度实验组和一个空白对照。在水箱中加入实验饲养水体积2L，每天更换全部实验饲养水，每隔12h观察记录环棱螺的活动和存活情况，连续观察96h，及时取出死亡个体，记录环棱螺的药物中毒情况及其死亡数量。采用寇氏(Korbor)法计算96h急性毒性实验的半致死浓度LC50和其95%的置信区间以及安全浓度[7-9]。

1.3 毒性暴露实验[10-12]

根据急性毒理实验结果，得到五氯酚钠的半致死质量浓度为：0.411mg·L-1。参考国家渔业水质标准中所规定的五氯酚钠的浓度为0.01mg·L-1，设置五氯酚钠的质量浓度梯度为：0.00 mg·L-1，0.02 mg·L-1，0.04 mg·L-1，0.10 mg·L-1进行实验。实验生物的染毒方式采用静态水质法，水温为16～25℃，pH6.4。在水箱中装入2L的实验用水，每一质量浓度组放入环棱螺 120只。将环棱螺进行不同五氯酚钠浓度梯度、不同时间的毒性暴露实验。实验期间，每天更换相同浓度的实验用水一次，每隔 24h 随机抽取12只环棱螺，置于冰盘中进行解剖，取其肝脏。用预冷的 PBS 缓冲液清洗，用滤纸吸干。

称取环棱螺肝脏放入玻璃匀浆器中，加入20倍体积的预冷PBS缓冲液（pH7.2）研磨成匀浆（所有操作均在冰上进行）。4℃ 10 000g离心10min，取上清测定蛋白质含量，并进行相关生物标志物的测定[13]。GSH活性的测定采用DTNB法[14]。SOD活性的测定采用NBT法[15]。 酶活力单位定义为：每mg 组织蛋白在1 mL 反应液中SOD 抑制率达50 %时所对应的SOD 量为1个活性单位(U) 。CAT活性的测定采用紫外吸收法[16]。酶活力单位定义为：以1min内SOD240减少0.1的酶量为1个酶活单位（U）。丙二醛（MDA）的测定采用TBA法[17]。

1.4 数据处理

采用Origin8.0软件绘图。SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，采用LSD法进行多重比较（P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著）。

2 结果分析

2.1 环棱螺的中毒症状与死亡鉴定

环棱螺在接触实验用水后，高浓度组首先出现中毒症状。其中毒症状表现为：腹足回缩力量随暴露时间的增加逐渐减弱，并伸出部分于壳外，伴有白色絮状物质溢到壳外；随着暴露时间进一步延长，环棱螺对外界刺激反应愈加迟缓直至死亡，腹足全部伸出壳外，肿胀泛白，对外界刺激再无反应，最终内脏与外壳脱离。

2.2 五氯酚钠对环棱螺半致死浓度和安全浓度的计算

用 SPSS 软件计算出 Na-PCP对环棱螺 96h的 LC50及其 95%置信区间分别是 0.411mg·L-1，(0.331～0.536mg·L-1)，用常规计算方法计算Na-PCP对环棱螺的安全浓度为0.0411mg·L-1。

图1 PCP-Na对环棱螺肝脏中GSH含量的影响

2.3 环棱螺各生物标志物的变化规律分析

2.3.1 不同浓度五氯酚钠对环棱螺肝脏中GSH含量的影响

如图1所示，暴露24h时，0.04 mg·L-1和0.10 mg·L-1剂量组肝脏中GSH含量显著增加（P＜0.01）。48h时，0.02 mg·L-1和0.04 mg·L-1剂量组肝脏中GSH的含量有所上升，但 0.10 mg·L-1剂量组肝脏中GSH较24h时含量下降。72h时，0.02 mg·L-1剂量组肝脏中 GSH 含量显著升高（P＜0.01），0.04 mg·L-1和0.10 mg·L-1剂量组肝脏中GSH含量降低。到96h时，0.02 mg·L-1和0.04 mg·L-1剂量组含量依旧高于对照组（P＜0.01），但0.10 mg·L-1剂量组肝脏组GSH含量恢复到对照组水平。

2.3.2 不同浓度五氯酚钠对环棱螺肝脏中SOD活性的影响

图2显示，在24h时，低剂量组（0.02mg·L-1）肝脏中的SOD活性显著高于对照组（P＜0.05），而 0.04 mg·L-1和 0.10mg·L-1剂量组肝脏中的SOD活性均受到抑制。48h时，各剂量组肝脏中的SOD均受到显著抑制（P＜0.01）。48h后，0.10 mg·L-1剂量组SOD活性持续增高，到96h时其活性显著高于对照组；0.02 mg·L-1和0.04 mg·L-1剂量组肝脏中SOD活性先下降，到72h时，两剂量组的酶活开始回升，到96h时活性达到对照组水平。

2.3.3 不同浓度五氯酚钠对环棱螺肝脏中CAT活性的影响

图2 PCP-Na对环棱螺肝脏中SOD活性的影响

图3 PCP-Na对环棱螺肝脏中CAT活性的影响

根据图3的结果，环棱螺肝脏在五氯酚钠暴露的0～24h内，CAT的活性均被诱导；但在24h后，各剂量组CAT活性均开始下降，48h时达到最低；从48h之后，各剂量组CAT活性开始升高，96h时明显高于对照组（P＜0.01）。

图4 PCP-Na对环棱螺肝脏中MDA含量的影响

2.3.4 不同浓度的五氯酚钠对环棱螺肝脏中MDA含量的影响

图4表明，PCP-Na胁迫初期（0～24h）各剂量组肝脏中的MDA含量均显著升高 (P＜0.05)。在24h 时，0.02mg·L-1和0.04mg·L-1剂量组肝脏中MDA含量达到最大值。24h之后MDA含量开始回落，0.10mg·L-1剂量组在24-48h内，其MDA的含量仍继续升高，在48h时达到最大值，此时含量明显高于对照组（P＜0.01），随后其含量逐渐下降，到 96h时，各剂量组肝脏中MDA的含量接近照组水平。

3 讨论

3.1 五氯酚钠暴露与环棱螺肝脏中GSH含量变化的关系

外源性化学物质进入生物细胞后，会导致大量活性氧的产生，活性氧是高活性的分子，与生物大分子如DNA、蛋白质和脂质相互作用而对生理过程产生影响。GSH作为非酶类抗氧化物质首先与外来化合物或自由基结合，保护细胞不受氧化损伤。当细胞中GSH不足以清除外来物质与自由基时，此时就会发生其他次级反应，如脂质过氧化或与细胞内其他大分子发生共价结合[18]。本次实验中，0.02 mg·L-1和0.04 mg·L-1剂量组环棱螺肝脏中GSH含量随着暴露时间的延长呈递增的趋势，原因可能是经五氯酚钠实验水处理使得肝脏中自由基含量增加，在没有超过GSH对毒性物质的饱和诱导量时，GSH含量增加。而对于0.10 mg·L-1剂量组，环棱螺肝脏中GSH含量先上升后降低，GSH含量的降低可能与细胞对污染物及其代谢物解毒能力的饱和效应有关，也可能是污染物长期毒性暴露效应反应的结果[11]。

3.2 五氯酚钠启动环棱螺肝脏中抗氧化酶系统的机制

目前，很多研究把超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等作为评价污染物对水生生物产生氧化胁迫的重要生物标志物。它们的活性可由于污染物的胁迫而发生改变，从而可以间接地反映环境中污染物的存在，因而可作为污染物胁迫的有效指标。用特定反应中关键酶的变化来证实污染物的影响，可以指示污染物对生态系统所产生的生物学效应，并能科学地评价污染物的环境风险，从而具有重要的理论和实践意义。SOD是使细胞免受氧化损伤的关健酶之一，能清除超氧自由基，催化使之转化为H2O2和O2，也与生物的抗污染胁迫密切相关。在暴露实验过程中的初期，暴露时间短，且环棱螺体内有非酶类抗氧化物质如GSH的作用，此时SOD和CAT活性没有显著升高。然而随着暴露时间的延长，SOD活性能够被显著诱导。本实验中，48h之后，暴露在不同浓度的五氯酚钠溶液中的环棱螺抗氧化系统启动，随着活性氧自由基的大量产生，SOD被诱导，活性不断上升，从而导致 H2O2在细胞中含量升高。CAT作为H2O2浓度的调节器，活性升高，加速分解H2O2。在本实验中，SOD和CAT的相关关系为：r=0.810，P＜0.01，这表明这两种酶密切相关，并具有一定的协同性。这与张清顺等研究铜对梨形环棱螺抗氧化酶活性影响中SOD和CAT的相关性的结果一致[11]。

SOD和CAT共同组成了生物体内活性氧的防御系统，在清除超氧自由基、H2O2以及阻止或减少羟自由基形成等方面发挥了重要的作用。通常生物体内抗氧化系统处于一种平衡状态，使自由基维持在一个较低的水平，从而能有效地防止氧自由基的毒害，一旦这种动态平衡受到破坏，就可能产生伤害作用[7]。因此很多研究把CAT和SOD作为评价外源化合物产生氧化胁迫的重要生物标志物。

3.3 五氯酚钠对环棱螺肝脏的脂质过氧化作用

生物在逆境胁迫条件下，体内自由基积累会导致生物膜脂质过氧化(lipid perxidation)的发生，从而降低了膜的流动性和选择通过性，破坏了生物膜的功能。MDA作为生物脂质过氧化的最终产物之一，其含量常被用来评价生物的脂质过氧化水平。在本次实验中，在PCP-Na胁迫的前中期肝脏产生了大量的活性氧自由基，引发了脂质过氧化，使得各剂量组肝脏中 MDA含量均明显升高，脂质过氧化损伤明显。而在毒物的持续胁迫下，由于抗氧化酶系统的全面激活和GSH含量上升后产生的保护作用，使脂质过氧化水平降低，MDA含量逐渐恢复到正常水平。

3.4 GSH、抗氧化酶及MDA的互动关系探讨

外源有机化合物及其代谢产物可引起生物体内活性氧自由基增加。为避免活性氧自由基引起蛋白氧化和脂质过氧化，使细胞受损，最终造成生物体正常生理机能的破坏，生物激活其体内的抗氧化防御系统，诱发非酶类抗氧化物质（如GSH）及抗氧化酶(如 SOD和CAT ) 的产生以清除机体内过多的活性氧自由基[19]。在五氯酚钠胁迫初期，GSH含量升高，清除外来化合物及活性中间体。当GSH不足以清除外来物质及自由基时，就可能启动抗氧化酶系统。在本次实验中，表现为胁迫初期GSH含量增加，较长时间（如48h）暴露后，SOD及CAT活性均被诱导增加。

机体抗氧化系统是一个复杂的系统，由非酶和抗氧化酶组成的抗氧化系统在机体抵抗氧化胁迫和消除自由基损伤时起着重要作用，并且某些抗氧化成分之间还能相互影响。本实验中，GSH、SOD、CAT及MDA围绕自由基清除和对机体损伤这个功能核心，各自起着作用，彼此间又密切相关[20]。

环棱螺耐旱能力极强，移位距离很小，以其为实验对象，采用生物标志法研究五氯酚钠的毒理效应，能够很好的反映五氯酚钠对环棱螺的氧化损伤作用和环棱螺的防御作用机制，进而为探讨持久性有机污染物对腹足动物的氧化损伤和防御作用机制提供基础资料，同时也为污染物的生物监测法提供更完善的资料。

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