如何做好一张HE染色切片

唐从国 郭周庆

如何做好一张HE染色切片

唐从国 郭周庆

（南方医科大学附属小榄医院病理科，广东中山528415）

探讨常规染色切片制作过程的全过程。重点介绍组织固定、取材、脱水透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、烤片、去蜡、加水、苏木素染色、分化、返蓝、伊红染色、封片等各个环节应注意的要点，推荐当前病理切片的质量评估标准。

HE染色；病理切片

HE染色是目前国内外病理诊断上广泛采用的常规染色方法。专家们曾指出：“一张好的HE切片是保证正确病理诊断的关键”［1］。切片质量的好坏，可直接影响疾病诊断的及时与准确性。作为一个合格的病理技术人员，能制作出一张高质量的HE染色切片，是必须掌握的技术之一。

1.病理技术工作者，首先要热爱本职工作，具有敬业精神，才会虚心学习，认真钻研。并认识到医师的诊断与技术人员制片的目的是一致的，都是为了病人早日恢复健康。

2.制片人员要有科学的态度，严格的要求和高度的责任感与熟练的技术，更要求严格遵守操作规程。

3.HE制作的全过程包括组织固定、取材、脱水、透明、浸蜡、包埋、修整蜡块、切片、贴片、烤片、去蜡、加水、苏木素染色、分化、水洗、返蓝、伊红染色、脱水、透明、封片等十多个步骤，每一步都必须仔细操作，即每一环节都必须高度重视，才能制作出高质量的HE染色切片，就每个环节应注意的问题阐述于下：

（1）组织固定 固定一定要及时，组织离体30 min内必须固定，且越新鲜固定越好，涂片、刷片、印片等尤其如此。配制固定液时，称药要准确，p H值调节要适当，固定液的选择与浓度的配制均要做好；固定液的用量以多于组织体积的5-10倍为宜。盛固定液的容器，瓶口要大，以防人为的挤压。由于10%福尔马林的组织渗透力约为每小时1 mm，渗入组织的深度约为2-3 mm［2］，故大标本要求正中先切开（如肝、脾）；肺则最好用支气管灌注10%福尔马林后再浸入固定液内、脑及眼球应用悬吊法固定。

（2）取材 大小1.5×1.5×0.2-0.3c m，厚度不宜超过0.5c m，取材整齐、平整、切成方形、圆形或矩形，不要切成三角形，要选取具有代表性的病变组织。内窥镜活检、诊断性刮宫等碎组织要用纱布包好，再用大头针扎紧后固定。

（3）脱水 利用梯度酒精逐步脱水，适当掌握其浓度与脱水的时间。加温脱水可使组织固缩，以室温脱水为佳；只有脱水彻底，组织才能透明充分，才有利于石蜡的渗入。脱水剂要定期更换，组织块的周围脂肪组织不宜过多，否则将引起脱水不良，难以切片。

（4）透明 一般用二甲苯，小块组织15-30 min，大块组织1h即可，透明的时间过长，组织容易变硬、变脆、切不成片，甚至一切就成粉末状，故要恰当地掌握组织块的透明度，正确控制透明的时间。

（5）浸蜡 先放入熔点低（54-56℃），后浸入熔点高的（58-60℃）石蜡；浸蜡的温度应高于所用石蜡熔点的5℃左右，但最高温度不宜超过65℃，小块组织0.5-1h，大块组织2-3h，温度过高或时间过长，均可使组织收缩、变硬、变脆、切不成片。如能采用低压真空方法，则浸蜡的时间可以适当地缩短。

（6）包埋 石蜡包埋的温度可以比浸蜡的温度高3-5℃，但动作要快，须将组织块放平整，尤其是两块以上的小组织或多块小组织应仔细地包埋成一条直线与包埋框横轴平行，这样既有利于防止病理医师诊断时不小心漏掉一块小组织同时也有利于完整地切片，形成蜡带；更要注意包埋面的解剖组织学关系，凡分层次的组织，层次表面应向下放平；皮肤可将表皮放在上端，应保证各层组织结构都能被观察到；如果包埋面的方向有错误，在镜下就无法观察到全层的组织结构，则必然会造成诊断上的困难。

（7）修整蜡块 包埋的蜡块，在冷却后应进行修整，组织块周围的蜡边不宜太宽，只需留下约2 mm的空间，以免贴片时不易被展开。

（8）切片 须备有一台优质的切片机，切片时，把固定蜡块的各个螺丝旋紧，刀要快，可定期更新一次性刀片，须无缺口，切3-5μm厚。组织的长轴应与切片刀平行，切片刀应先从刀的一端使用，角度4-6°，角度太大会将切片刮碎，过小则切不到组织，切片时将组织切齐全，要求厚薄均匀且形成蜡带，避免人为损害。蜡块内的被膜应放上端，组织的脏层应朝下；淋巴瘤或细菌染色宜薄切，观察髓鞘神经轴索则可切厚些。

（9）贴片 只要载玻片洁净，切片成带，摊片箱内水温适当（45-50℃），切片就能全面展开。如果展开不平整，可先用30%的酒精初展，然后在摊片箱内复展，这样一般能得到一张完整漂亮的切片；如果切片有皱褶，可用小镊子协助展开，切片可贴在载玻片右侧1／3处，贴平整，一般大组织只贴一块，小组织可多贴几块，但要排列对称，整齐美观。如果摊片箱内水温过高，蜡片会融化，组织会离散；如果摊片箱内有组织碎屑或蜡屑，可用纸类贴于水的表面清除，以防止污染切片。

（10）烤片 烤片时温度的控制与时间的把握最为重要，温度过高，组织与细胞会出现龟裂；温度过低或烤片时间不足，切下的组织块容易脱落，一般65℃烤20-30 min，可防止上述现象。

（11）脱蜡、水化，苏木素染色 染色前，切片须经过两次二甲苯脱蜡，务求将石蜡脱尽，再经梯度酒精脱苯，最后至水，再入苏木素液染色。该染液的配置要准确，染色时间的控制应依据苏木素的配方、染液的新旧、季节、室温等多种因素综合考虑，一般情况下染5-15 min；冬天，室温过低苏木素的钾明矾容易析出，影响染色效果，可加温染液。

（12）盐酸分化 染苏木素后，除胞核着色外，胞浆，间质等也不同程度被染上了淡兰色。分化的目的是让应着色的细胞核更加清晰，使不应着色的部分，尽可能褪尽。分化的时间要看分化液的浓度，溶液的新旧，组织本身的特性，切片的厚薄及要求着色的深浅等因素酌情来定，最好是在显微镜观察下控制，一般分化数秒至30s。分化后的切片应立即入水中冲洗，让组织碱化，使胞核返兰。应注意的是：①入水动作要轻；②用细流水冲洗，请勿直接对着切片冲洗，以免脱片。③碱化采用自来水或温水（30-40℃），让其自然返兰并洗净残留的盐酸，有利于切片的长期保存。如果用碳酸锂，氨水等弱碱来返兰，切片则较易褪色。

（13）伊红染色 在每100 ml伊红染液内加1滴冰醋酸可起到促染的作用。染色时间应依据伊红的配方及染液的新旧来灵活掌握。伊红有水溶性及酒精溶性两种，一般染1-3 min。酒精伊红着色快，且颜色鲜艳。

（14）完成了苏木素与伊红两种染料的染色，即HE染色，尚须用不同浓度的酒精彻底脱水，再用二甲苯充分透明后，方可用树胶封片。必须注意的是：①载玻片与盖玻片均要求洁净。②树胶要保持中性，其浓度要适当，量要适中，以防树胶溢出或封固不全。③盖片周围多余的，溢出的中性树胶要擦净，盖玻片要放正。封片时盖玻片要稍大于组织块，以保证组织块已被全部封存在内。④盖片时动作要轻，倾斜角度要适当，以免产生气泡。

讨 论

1.应该指出的是：从组织的固定，取材，脱水，透明，浸蜡，包埋，切片，染色，封片等一系列的操作均要求制片人员必须具有细心、耐心和很强的责任心，要明确任何环节出现了问题，都将影响到制片的质量，从而影响到医师的正确诊断［3］。

2.在制片过程中，注意①在封片时，如果见切片呈云雾状，则说明酒精，二甲苯已陈旧，内已含有水份，应立即更换并重新脱水与透明。②在整个制片过程中，不要让切片完全干燥，以防细胞固缩，组织龟裂，且影响折光率。③封片以后，不要将切片置入温箱内，因加热可使树胶氧化，变为酸性，促使切片褪色。

3.病理切片的质量评估：北京的梁晓俐2004年曾经提出过两条标准：一：切片完整，厚4-6μm，厚薄均匀，无皱褶，无刀痕。二：细胞核、质染色分明，红兰适度，透明，洁净，封固美观。最近，广州的梁英杰，凌启波等又提出了八条评估标准［4］：①切片完整，贴片恰当。②切片较薄和均匀，无污染。③无皱褶。④无刀痕。⑤染色清晰，核质分明，透明度好。⑥无固缩、龟裂、‘炭化’胞核。⑦封片适当，玻片整洁。⑧字体端正，号码清楚。

总之，切片质量的稳定是一项持之以恒的日常工作。在切片全过程的每一个环节，如果技术处理失当都必然会影响诊断的准确性［5］，病理前辈们曾指出：“病理学的理论和技术同样重要，它被视作一辆车的两个车轮，缺一不可，互为依存，互相促进，两者的结合，决定着病理学的发展”［6］。

［1］刘彤华，李维华主编：诊断病理学，第1版，北京，人民卫生出版社，1994，4

［2］唐从国.病理工作者要重视常规切片的制作.中华医学进展杂志，2006，4（3）：72-73

［3］刘桦，卢鹤翔.影响病理切片制作的因素及质量控制.中国煤炭工业医学院杂志，2005，8（12）：1334

［4］梁英杰，凌启波，张威.临床病理学技术，第1版，北京，人民卫生出版社，2011，80

［5］唐从国.关于病理技术处理失当问题的探讨.中国组织化学与细胞化学杂志，2010，19（5）：524-526

［6］梁晓俐.病理学基础与实验技术，第1版，北京，军事医学科学院出版社，2004，前言

R362

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10.3870／zgzzhx.2012.04.024

2012-03-30

2012-06-01

唐从国，男（1971年），汉族，主管技师。