肾脏纤维化与间充质转分化

封怡多，张东亮，刘文虎

肾脏纤维化以肾小球硬化及肾小管间质纤维化 (renal interstitial fibrosis，RIF)为主要特征，是各种慢性肾脏疾病(chronic kidney disease，CKD)发展为终末期肾病 (end－stage renal disease，ESRD)的共同途径。近几年，上皮间充质转分化 (epithelial－mesenchymal transition，EMT)被认为是受损肾脏产生肌成纤维细胞的关键。但新近研究表明，内皮细胞与足细胞也可发生间充质转分化［1－3］，导致肾小球硬化以及蛋白尿。本文对肾脏间充质转分化最新观点以及可能的治疗靶点做一综述。

1 肾脏实质细胞与EMT

1.1 肾小管上皮细胞与EMT 大量研究证实，肾小管上皮细胞在体外经过转化生长因子β(TGF－β)刺激后可发生表型转化，这种转变以失去上皮细胞表型如E－cadherin、zonula occludens－1(ZO －1)等和获得间充质细胞表型如α平滑肌肌动蛋白 (α－SMA)、成纤维细胞特异性蛋白－1(FSP－1)、间质细胞I型胶原等为特征［4－5］。

Strutz等［3］在抗肾小管基底膜疾病的小鼠模型中发现FSP－1可以在肾小管上皮细胞表达，首次证实EMT参与肾纤维化的形成。随后，Lan等［6］在大鼠5/6肾切除肾小球硬化模型中提供了EMT存在的形态学和表型转化的证据。Rastaldi等［7］报道了133例不同肾病患者肾活检结果，发现具有EMT特性的肾小管上皮数量与血清肌酐浓度及肾间质损害程度密切相关，表明EMT参与人肾脏纤维化过程。

1.2 内皮细胞与EMT 新近研究表明，通过内皮细胞－间充质转分化 (endothelial－to－mesenchymaltransition，EndoMT)，内皮细胞可表达成纤维细胞的标志物。Zeisberg等［1］使用了3种小鼠CKD模型来证明EndoMT对肾脏纤维化的作用，发现30%～50%成纤维细胞既表达内皮细胞标志CD31，又表达成纤维细胞和肌成纤维细胞标志，如FSP1和α－SMA。用Tie2－Cre追踪标记内皮细胞和R26R－stop－EYFP转基因小鼠也证明内皮细胞可以转分化为成纤维细胞，证实EndoMT在肾脏纤维化过程中对成纤维细胞和肌成纤维细胞的产生和积聚起着重要的作用。研究证实，EndoMT和EMT一样，也可被TGF－β诱导产生，抑制TGF－β/Smad通路有可能对抑制组织纤维化甚至肿瘤形成有积极的作用［8］。研究证实，EndoMT在糖尿病肾脏纤维化早期的发生发展过程中起重要作用［9－10］。

1.3 足细胞与EMT 足细胞的功能缺失在蛋白尿形成以及肾小球硬化的发生发展中起重要作用，可最终引起肾脏纤维化。研究表明肾小球足细胞也可发生表型的改变，并导致足细胞功能的缺失。体外培养的足细胞中加入TGF－β1后，细胞间隙增大，伴随P－cadherin、ZO－1的产生;与此同时，细胞开始表达间质纤维蛋白desmin、基质金属蛋白酶－9(MMP－9)、I型胶原和正调节转录因子Snail，最终可损伤足细胞滤过屏障［2］。在糖尿病肾病以及局灶性节段性肾小球硬化 (FSGS)等以蛋白尿为主要表现的肾小球疾病中也可观察到肾小球足细胞表型的改变，伴有明显的足细胞形态和功能异常。Yamaguchi等［9］对49例糖尿病患者进行了肾活检，证实其肾组织以及尿中足细胞的FSP－1表型阳性率与糖尿病所致肾损害严重程度呈正相关。此外，ILK(integrinlinked kinase)信号通路在足细胞表型改变中起重要作用，ILK的上调可引起肾小球足细胞的间充质转分化、细胞迁移以及功能缺失等，提示ILK可能是蛋白尿相关肾脏疾病的有效治疗靶点［11－12］。

然而，目前对足细胞EMT的概念仍存在争论。虽然体外培养的足细胞正常形态呈铺路石状，然而分化的足细胞形成许多纺锤样突起，而且体内的正常足细胞具有多级足突并且表达少量波形蛋白 (vimentin)，所以，与肾小管上皮细胞比较，足细胞本身具有更多的间充质细胞的性状，在被损伤或患病后，这些间充质标志物表达会进一步上调。不同于小管上皮细胞EMT后侵入肾间质并转变为成纤维细胞，足细胞EMT后反而获得自动性，导致其从肾小球基底膜 (GBM)上脱落并被冲入尿液中排出体外［13］。

2 EMT的细胞内信号转导及机制

目前关于EMT的分子生物学机制研究已经较为深入，在CKD的机体环境中，主要存在的传导通路有 TGF－β/Smad、integrin/ILK信号通路等，这些信号传导途径是相互联系的一个整体，控制EMT的转录调节和信号传导。

2.1 TGF－β与EMT TGF－β是多功能的细胞因子，除了可使成纤维细胞聚集和增殖外，还可通过EMT途径导致组织的纤维化［14］。大量动物实验及临床研究证实TGF－β在CKD中的表达显著增高，推断TGF－β引起的EMT在肾脏纤维化的发病机制中起到了关键作用。

2.2 TGF－β/Smads通路与EMT 在纤维化的肾脏中，TGF－β的表达普遍上调。TGF－β与跨膜受体Ⅰ (TβRⅠ)和跨膜受体Ⅱ (TβRⅡ)相结合，TβRⅡ使TβRⅠ磷酸化，诱导Smad2和Smad3磷酸化和激活，磷酸化的Smad2或Smad3与Smad4结合后转移到核内，在核内调节TGF－β相关的基因转录。而 Smad6及Smad7可阻碍Smad2、Smad3与TβRⅠ的结合从而抑制EMT的发生。与TGF－β在EMT中的诱导作用相一致，这些相关受体以及Smad家族也在EMT中发挥着很重要的作用。

研究证实，Smad突变体的表达可以干扰Smad的功能，应用小干扰RNA下调Smad的表达同样可以抑制上皮细胞向间充质细胞的表型转换［15－16］。然而一些研究发现，Smad2可以作为TGF－β的拮抗体影响TGF－β所致的EMT过程，其机制可能与Smad2的缺失增强了Smad3及Smad4的表达有关［17］。另外，抑制体Smad7的高表达可抑制各种上皮细胞中TGF－β所致的 EMT。在受损的肾脏中Smad表达亢进，不仅是因为TGF－β的表达上调，还因为Smad相互调节失衡。Smad信号还可通过肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)和骨形态蛋白7(bone morphogenic protein－7，BMP －7) 抑制 EMT［15－16］。

2.3 导致EMT的其他信号通路 ILK是一种细胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，研究表明integrin/ILK信号通路在TGF－β所致的EMT中起关键作用，TGF－β可通过Smad依赖性信号通路促进ILK的表达，引起间充质转分化。另外，ILK可导致基质金属蛋白酶－2(MMP－2)表达，促使细胞在基底膜基质中发生细胞迁移及浸润。

其他诸如 Wnt/β－catenin信号通路在肾小管和足细胞EMT中的潜在作用目前仍不十分肯定［18］。胞内的多种信号通路相互联系、相互作用，激活β连环蛋白，从而影响许多β连环蛋白目的基因的表达，如 Snail1、Twist等，最终导致EMT转录途径的激活。

3 肾脏纤维化的EMT治疗靶点

EMT包含了大量的胞内信号级联反应及调节机制，理论上阻断其中任何一步均可能削弱EMT过程，防止纤维化的发生。很多研究试图通过抑制TGF－β阻止肾纤维化进展，包括反义核苷酸、抗TGF－β抗体等，然而研究发现长期抑制TGF－β会诱发炎症。有研究证实阻断Smad信号通路后发现可延缓肾脏纤维化，如Li等［19］发现Smad3特异性抑制物SIS3可有效抑制Smad3的磷酸化，抑制EndoMT的发生，在链霉素诱导的糖尿病肾病模型中阻止了肾脏结构的改变，起到了保护肾脏功能的作用。另有研究表明，应用小分子抑制剂 QLT－0267抑制 ILK，可废除TGF－β所致的cyclinD1的表达，在很大程度上保留了E－cadherin及闭锁小带的表达。在梗阻性肾病模型的大鼠体内，QLT－0267抑制了β－catenin的积聚，抑制了Snail1、α－SMA、粘连蛋白、vimentin以及Ⅰ型和Ⅱ型胶原的表达［20］。此外，最近研究发现了一些内源性抗纤维化蛋白，尤其是肝细胞生长因子 (HGF)和BMP－7，能拮抗TGF－β的促纤维化作用，而C－肽 (C－peptide)及骨形成蛋白－2(BMP－2)等因子可通过修饰TGF－β信号通路阻碍EMT的发生［21］。

4 前景与展望

肾小管上皮细胞、内皮细胞、足细胞均可发生间充质转分化。TGF－β/Smad、integrin/ILK等信号传导对EMT起着重要的介导作用。这些研究将为抑制和逆转肾脏间充质转分化提供新的线索，最终将为临床治疗肾脏纤维化提供新的干预手段。如能寻找到有效的逆转间充质转分化的方法将使CKD的治疗登上一个新的台阶。

1 Zeisberg EM，Potenta SE，Sugimoto H，et al.Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial－to－mesenchymal transition ［J］.J Am Soc Nephrol，2008，19(12):2282 －2287.

2 Li Y，Kang YS，Dai C，et al.Epithelial－ to－mesenchymal transition is a potential pathway leading to podocyte dysfunction and proteinuria ［J］. Am J Pathol，2008，172(2):299－308.

3 Strutz FM.EMT and proteinuria as progression factors［J］.Kidney Int，2009，75(5):475－481.

4 van Meeteren LA，ten Dijke P.Regulation of endothelial cell plasticity by TGF － β ［J］.Cell Tissue Res，2012，347(1):177 －186.

5 Arciniegas E，Neves YC，Carrillo LM.Potential role for insulin－like growth factor Ⅱ and vitronectin in the endothelial－mesenchymal transition process ［J］.Differentiation，2006，74(6):277－292.

6 Lan HY，Ng YY，Huang TP，et al.Tubular epithelial－myofibroblast transdifferentiation in progressive tubulointerstitial fibrosis in 5/6 nephrectomized rats ［J］.Kidney Int，1998，54(3):864－876.

7 Rastaldi MP，Ferrario F，Giardino L，et al.Epithelial－mesenchymal transition of tubular epithelial cells in human renal biopsies［J］.Kidney Int，2002，62(1):137 －146.

8 Li J，Qu X，Bertram JF.Endothelial－ myofibroblast transition contributes to the early development of diabetic renal interstitial fibrosis in streptozotocin－induced diabetic mice［J］.Am J Pathol，2009，175(4):1380 －1388.

9 Yamaguchi Y，Iwano M，Suzuki D，et al.Epithelial－mesenchymal transition as a potential explanation for podocyte depletion in diabetic nephropathy ［J］.Am J Kidney Dis，2009，54(4):653－664.

10 Kang YS，Li Y，Dai C，et al.Inhibition of integrin－linked kinase blocks podocyte epithelial－mesenchymal transition and ameliorates proteinuria ［J］.Kidney Int，2010，78(4):363－373.

11 Liu Y.New insights into epithelial－mesenchymal transition in kidney fibrosis［J］.J Am Soc Nephrol，2010，21(2):212－22.

12 Lamouille S，Derynck R.Emergence of the phosphoinositide 3－kinase－Akt－mammalian target of rapamycin axis in transforming growth factor－beta－induced epithelialmesenchymal transition［J］.Cells Tissues Organs，2011，193(1－2):8－22.

13 Valcourt U，Kowanetz M，Niimi H，et al.TGF－beta and the Smad signaling pathway support transcriptomic reprogramming during epithelial－ mesenchymal cell transition ［J］.Mol Biol Cell，2005，16(4):1987 －2002.

14 Deckers M，van Dinther M，Buijs J，et al.The tumor suppressor Smad4 is required for transforming growth factor beta－induced epithelial to mesenchymal transition and bone metastasis of breast cancer cells［J］.Cancer Res，2006，66(4):2202 －2209.

15 Hoot KE，Lighthall J，Han G，et al.Keratinocyte－specific Smad2 ablation results in increased epithelial－mesenchymal transition during skin cancer formation and progression［J］.J Clin Invest，2008，118(8):2722－2732.

16 Yang J，Dai C，Liu Y.A novel mechanism by which hepatocyte growth factor blocks tubular epithelial to mesenchymal transition［J］.J Am Soc Nephrol，2005，16(1):68－78.

17 Liu Y.Hepatocyte growth factor in kidney fibrosis:therapeutic potential and mechanisms of action ［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2004，287(1):F7－F16.

18 Huang H，He X.Wnt/beta－catenin signaling:new(and old)players and new insights［J］.Curr Opin Cell Biol，2008，20(2):119－125.

19 Li J，Qu X，Yao J，et al.Blockade of endothelial－mesenchymal transition by a Smad3 inhibitor delays the early development of streptozotocin－induced diabetic nephropathy［J］.Diabetes，2010，59(10):2612 －2624.

20 Li Y，Tan X，Dai C，et al.Inhibition of integrin－linked kinase attenuates renal interstitial fibrosis ［J］.J Am Soc Nephrol，2009，20(9):1907－1918.

21 Hills CE，Al－Rasheed N，Al－Rasheed N，et al.C－peptide reverses TGF－beta1－induced changes in renal proximal tubular cells:implications for treatment of diabetic nephropathy ［J］. Am J Physiol Renal Physiol，2009，296(3):F614－F621.