慢性疲劳综合征与XMRV关系之争＊

张拥军

2011年12月23日，美国《科学》杂志罕见地在未征得当事人同意的情况下，宣布全部撤销了2009年刊登的一篇文章［1］，至此，这场吸引国际上众多科学家参与、历时两年多的慢性疲劳综合征与XMRV关系的争论落下帷幕。本文拟对这一事件的来龙去脉进行综述，及时澄清可能产生的一些误导，探讨该事件对今后病原生物学研究领域的启迪。

1 起因——XMRV与慢性疲劳综合征相关假说的提出

1．1 慢性疲劳综合征 慢性疲劳综合征（chr onic fatigue syndrome，CFS）又称为肌痛性脑脊髓炎（myal gic encephalo myelitis，ME），是一种以慢性疲劳为主要表现的临床综合征。主要症状包括持续6个月以上不明原因的持续性疲劳，活动能力的显著下降，即使适度休息也不能减轻。出现记忆力下降、睡眠障碍、全身关节和肌肉疼痛、咽喉酸痛、头痛、淋巴结触痛等症状，还可能出现其它症状如腹痛、恶心、腹泻、胸痛、对光声音和气味敏感、抑郁、易激惹、焦虑等［2－4］。据估计，全球有大约1 700万不同程度的CFS病例，多为女性，男女比例为1∶6［4］。

关于CFS的致病因子，多年来一直没有定论。曾经有人提出过CFS产生及症状持续的生物学、遗传学、感染以及心理学机制，其中候选的感染因子有EB病毒、肠道病毒、细小病毒B19、博尔纳病毒、贝氏柯克斯体、肺炎衣原体等，均告失败［2－4］。因此，CFS病例缺乏具有诊断价值的特征性异常指标。

目前CFS研究中，广泛采用的是1994年美国CDC修订的诊断标准。在CFS的治疗方面，药物治疗的作用十分有限［3］，也不存在特异性治疗药物。

1．2 XMRV 异嗜性鼠白血病病毒相关病毒（xenotr opic murine leukemia vir us－related vir us，XMRV）为单股RNA病毒，属于逆转录病毒科，γ－逆转录病毒属，同属的还有鼠白血病病毒（MLV）、Friend病毒、猫白血病病毒（FLV）等。XMRV基因组全长约8100个核苷酸，与多种小鼠的内源性逆转录病毒同源性达95%，而与部分小鼠外源性病毒相似性为93%～94%［5］。2006年首次发现XMRV，并认为该病毒感染与前列腺癌存在一定联系。

1．3 2009年《科学》论文 2009年10月，美国内华达州 Whittemore Peterson研究所（WPI）的 Mikovits实验室在《科学》杂志发表《在CFS患者血液细胞中感染性逆转录病毒XMRV的检测》一文，首次宣布了该实验室的研究成果［1］。他们发现从101例CFS患者外周单核细胞（PBMCs）中，有68例（67%）检测到XMRV的gag基因序列，而218名健康对照仅检出8例（3．7%）。而且，他们的合作实验室——CCF的Sil ver man实验室也通过PCR扩增和序列测定证实了11例WPI提供的CFS样品中，有7例患者的PBMC DNA中检测到352nt的XMRV env基因片段和736 nt的gag基因片段。同时，他们还采用流式细胞仪和蛋白印迹的方法测定了患者PBMC中XMRV的蛋白表达，并发现从一名患者PBMC分离的T细胞和B细胞经过活化，能够感染XMRV。细胞培养也显示来自患者的XMRV具有感染性，病毒可能通过细胞和无细胞传播。未感染的原代淋巴细胞及指示细胞系暴露于激活的CFS患者PBMCs、B细胞、T细胞或血浆均可引起继发感染。根据以上几个方面的事实，作者认为XMRV可能是CFS致病的促进因子。

这篇论文在《科学》杂志发表后，立即受到全世界新闻媒体、病毒学及CFS临床和研究领域的高度关注。虽然少数学者仍然持怀疑态度，一些知名学者还是根据文章里提供的数据肯定了这项发现的重要意义。而2010年8月，美国国立卫生研究院（NI H）、食品药品管理署（FDA）以及哈佛大学的研究人员联合发表在美国《国家科学院院刊》的论文，也支持了《科学》论文中类似的观点［6］。虽然他们检测到的不是XMRV本身的序列，但他们发现90年代中期，哈佛大学CFS专家Ant hony Ko mar off收集的37名CFS患者样品（PBMC和全血）中，有32名（87%）可以检测到 MLV相关病毒（MLV－related vir us）的gag基因序列，而44名健康对照仅3名（6．8%）阳性。

1．4 影响 这篇论文的问世，迅速在生物医学多个领域产生了巨大影响。在CFS研究领域，研究人员正苦于找不到合适的生物致病因子作为诊断指标，因此当务之急是尽快证实该病毒在本地CFS研究人群中的检出率，以便及时调整研究方向和策略，有针对性地研制相应的治疗药物；对诊断试剂厂商来说，无疑是一个新的商机。尽快研发特异而稳定的诊断试剂，意味着早日占领市场，最初的诊断试剂就一度超过600美元；对血液中心，如果CFS患者XMRV感染率较高，病毒是否会通过输血传播，直接关系到输血安全。因此需要对献血员进行筛查，并考虑是否应该对CFS患者献血采取限制措施；而对CFS患者，一旦证实XMRV感染是致病元凶，就可能结束CFS无药可治的困境，也意味着可以尝试一些抗逆转录药物治疗。为了早日康复，甚至有患者已经迫不及待地开始自行服用这类药物。

2 质疑——令人失望的XMRV检出率

然而，《科学》论文刊出后不久，接踵而至的质疑估计作者始料未及。尽管没有统一的标准试剂，世界各地一直致力于CFS致病因子研究的团队立即创建了各自的相关检测体系，重新检测现有患者样品中XMRV。令人惊奇的是，得到的检出率与该文结果大相径庭。其中，英国伦敦帝国大学的 Mc－Cl ure实验室［7］率先报告了他们的阴性结果。他们从186名CFS患者血液样品中提取DNA，用套式PCR的方法检测可能存在的XMRV前病毒序列，但没有发现任何XMRV或MLV相关序列。而后，英国国家医学研究所也报告了类似结果［8］。他们检测了170名CFS患者及395名对照的样品，用PCR方法未能从299份样品（患者及健康对照）中检测到XMRV相关DNA，血清学方法从565份样品中发现26份有中和抗体阳性，但只有1份为CFS病例。几乎同时，荷兰学者［9］对76名CFS患者及69名对照PBMC，采用实时荧光PCR检测X MRV整合酶基因及套式PCR检测gag基因，也没有检测到XMRV序列。除了CFS人群，为了确定CFS献血员或其它人群中是否存在XMRV，保障输血安全，各国研究人员还对部分献血员血样进行了筛查，普遍得到极低的检出率［10］。因此，随着一系列阴性结果的出炉，人们逐渐开始怀疑该论文的结果，如此悬殊的检出率，究竟是XMRV毒株的变异？患者群体的差异（地域、种属、病例标准）？还是实验室污染？而面对蜂拥而至的质疑，Mikovits实验室［11］强调这些阴性结果采用的检测方法和实验步骤与他们论文中描述的不完全一致，尤其是样品DNA不是来自经过活化的PBMC，检出率会低一些。

3 验证——多家实验室参与的联合调查

为了打消公众的疑虑，准备平行盲样、采用敏感性相当的检测方法、同时在多家实验室进行检测得出的结果才最具有说服力。美国CDC［12］采集了51例CFS患者及56名健康人血样，CDC的实验室采用蛋白印迹实验发现51例CFS及53名对照均为阴性，德国的罗伯特．郭霍研究所（Robert Koch－Instit ute，RKI，为德国联邦公共卫生机构）实验室采用ELISA方法发现51例CFS及53名对照各有一例弱阳性；而CDC实验室还用套式PCR方法检测病毒gag和env基因，50名CFS患者、56名对照、41名献血员全部阴性；美国加州一家实验室也获得了同样的PCR结果。这样的结果显然不支持XMRV与CFS存在联系。随后，NI H组织了9个实验室（其中包括来自 WPI、NI H、CDC、FDA等机构的实验室）参与的盲样测试［13］。他们采集了15名以前报道XMRV／MLV阳性的血样（其中14例为CFS），以及15名先前报道阴性的健康献血员，编号，以盲样分发给9家实验室，检测XMRV／MLV核酸、病毒复制和抗体。结果仅2家实验室发现XMRV／MLVs相关证据；尽管所有实验方法对CFS样品及阴性对照的敏感性相似，得到的平行样品结果却不一致，说明目前血样中XMRV／MLV的检测方法重复性较差，不足以用于献血员筛查。另外，一项规模更大、由哥伦比亚大学Ian Lipkin实验室率领的调查仍然在进行中，该项目由NI H下属的国家过敏及传染性疾病研究所（NIAID）资助，有WPI、NI H及CDC几家实验室参与，测试对象来自150名CFS患者、150名健康对照样品，患者群体分别来自6个美国临床机构［14］。

4 证据——假阳性的源头

但2010年底，陆续出现一系列不利于Mikovits实验室的证据，实验室污染源头包括样品制备、试剂及细胞系本身等多个因素［15－19］。

首先，样品制备过程中可能出现污染，尤其是鼠源DNA污染。对于经常开展小鼠细胞系（如NI H3 T3）及动物实验的实验室来说，鼠源DNA无处不在，因此在采血、PBMC分离以及DNA纯化步骤，极有可能混入鼠源DNA。最初的质疑多数采用PCR扩增XMRV相关片段的方法（传统PCR、RTPCR、套式PCR或实时荧光PCR等），因此又暴露出一系列来自PCR试剂的污染源。由于PCR突出的扩增效率，尤其是套式PCR需要对首轮产物进行二次扩增，在提高了检测灵敏度的同时，也增加了假阳性的风险。美国CDC的实验室［15］调查发现，6个厂家的重组逆转录酶，无论是来自MLV还是A MV，都存在MLV的pol基因DNA序列，而不是gag基因或小鼠DNA。由于序列分析显示与Moloney MLV高度相关，推测是存在含RTase基因的质粒污染。而一些商业化PCR试剂盒中，采用了热启动Taq DNA聚合酶，其中关键的单克隆抗体，制备过程中可能会带来痕量小鼠DNA［16］。这些痕量小鼠DNA的存在，很难排除一些小鼠内源性逆转录病毒前病毒的污染，因此对先前从CFS患者样品检出X MRV／MLV序列的结果高度怀疑。

然而，更加致命的证据是发现细胞系受到污染。PNAS论文发表后，英国学者［18］就通过序列分析，发现前列腺癌细胞系22 Rv1中的X MRV序列是所有CFS患者序列的祖先，PCR检测到的患者XMRV片段可能是小鼠DNA污染所致，22Rv1细胞系可能在裸鼠体内移植过程中感染了XMRV。随后，几家美国实验室合作［19］，通过对22 Rv1相关的一系列细胞系遗传背景的研究，发现最初的人类前列腺癌细胞系CWR22并不存在XMRV。在小鼠体内传代过程中，前病毒Pre－XMRV1与 Pre－XMRV2发生重组，现在常用的22Rv1细胞系中的XMRV实际为两种小鼠内源性逆转录病毒重组的产物。而且，通过分析这些前病毒在小鼠基因组染色体位点以及整合位点等资料，发现Pre－XMRV1主要存在于亚洲小鼠，而Pre－XMRV2存在于欧洲小鼠。没有任何一个野生小鼠系同时含有这两种前病毒，仅在3个实验小鼠品系中同时存在这两种前病毒［20］。另外，针对PNAS论文中检测到的相隔15年的CFS患者病毒序列，英国学者同样通过序列分析［21］，发现在两个时间点的患者序列代表的是完全不同的内源性小鼠逆转录病毒，显然不符合逆转录病毒在患者体内的进化模式，表明存在污染。

虽然面对质疑，有两位这篇《科学》论文的作者后来在重复检测样品时，发现部分CFS患者PBMC DNA提取过程中存在XMRV质粒的污染，于2011年10月同意对该文部分撤稿，其余作者仍然不同意全部撤稿。在12月23日《科学》正式撤稿出台后，12月28日唯一支持该文的PNAS论文也被撤稿。

5 XMRV事件的反思

前后持续了两年多的XMRV与CFS关系之争，为了证明这个假说的真伪，牵涉了多个国家众多研究人员参与。对于病原生物学领域来说，尤其是今后提出任何新的病原体感染与人类疾病的关系，这场争论值得研究人员反思。首先，需要随时警惕实验室污染。这次事件的调查表明，除了偶尔操作不当可能引入污染，一些厂商的PCR试剂（DNA聚合酶和逆转录酶）也可能会有痕量的鼠源DNA污染，同时，一些关键实验步骤中新引进的细胞系，必须清楚其来源及传代背景。其次，不要迷信权威。虽然这次事件的始作俑者是一家不知名的私立实验室，但在质疑声中，也有一些知名科学家以及部分FDA、NI H的实验室参与，甚至轻率地得出了错误的结论，使质疑过程拖延了过长时间。再次，今后提出任何新的病原体感染与人类疾病关系的假说，都需要严格遵循“郭霍原则”或者“分子郭霍原则”，并进行严谨的实验证明，谨慎得出结论，以免误导公众。

［1］Lo mbardi VC，Ruscetti FW，Das Gupta J，etal．Detection of an infectious retr ovir us，XMRV，in blood cells of patients with chronic fatigue syndro me［J］．Science，2009，326（5952）：585－589．DOI：10．1126／science．1179052

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