致病菌碳源代谢与毒力调控的关联性＊

周妍妍，阚 飙

在自然环境中，细菌需要应对生长环境（温度、盐浓度、氧气、营养素等）的不断变化。细菌发展了一些机制以适应这些环境的变化。其中，对可用碳源的适应性机制是其中的重要方面。碳源是细菌对复杂环境作出适应反应的信号之一，某种特定碳源的出现也许使细菌感受到正处于感染相关的机体组织或细胞中，从而促使毒力基因表达。本文就致病菌碳源代谢与毒力调控的关联性进行综述。

1 细菌碳源代谢机制

细菌对可用碳源的适应性机制包括：当特定碳源存在时诱导对该碳源的跨膜转运并加以利用，主要通过碳源磷酸转移酶系统（carbohydrate phosphotransferase system，PTS）摄取，也可以经ABC转运 蛋 白 （ATP－binding cassette transporters）和GPH 转 运 蛋 白 （galactoside－pentose hexuronide translocators）进行碳源的跨膜转运；若同时存在几种碳源，细菌会优先利用最有效的碳源并抑制对其他碳源利用，即碳源降解物阻遏（carbon catabolite repression，CCR）。在肠道菌和革兰阳性菌中，PTS介导CCR作用。PTS［1］是很重要的感应并控制碳源代谢的系统，能摄取并磷酸化多达20种PTS糖及其衍生物，其以磷酸烯醇丙酮酸（PEP）作为磷酸基团的供体，EI发生自磷酸化后将磷酸基团转移给HPr，HPr又将磷酸基团传递给EIIA。除果糖PTS系统外，共用磷酸基团转运蛋白EI和HPr向特异EII蛋白传递磷酸基团。已知的EII蛋白由三个以上的结构和功能域组成，通常称为EIIA、EIIB、EIIC。EIIA、EIIB成分作为HPr与底物之间的磷酸传递体，而EIIC成分通常包含多个（螺旋结构，嵌于膜内形成疏水通道。通常，EI、HPr、EIIA和甘露糖的EIIB的组氨酸残基被磷酸化，而其他EIIB是半胱氨酸残基磷酸化。革兰阳性菌和一些革兰阴性菌的HPr色氨酸残基能被磷酸化。PTS蛋白的磷酸化状态具有很重要的调节功能。

在肠道菌里，CCR主要是通过去磷酸化的EIIAGlc（Glc，葡萄糖glucose）［2］介导。当有效的碳源存在时，去磷酸化的EIIAGlc抑制乳糖、蜜二糖通透酶，麦芽糖运载蛋白MalK和甘油激酶的活性，从而影响这些糖醇的吸收利用，也即诱导排斥（Inducer exclusion）。

革兰阳性菌的CCR主要通过HPr介导。革兰阳性菌的六聚体酶 HprK／P （HPr kinase／P－Ser－HPr phosphorylase）介导HPr的丝氨酸残基磷酸化或去磷酸化。当高效源如葡萄糖、果糖被摄取时，非PEP和EI的有效底物的P－Ser－HPr含量升高，抑制了其它碳源通过PTS的摄取。当只有低效碳源存在时，菌内无机磷酸盐含量升高，HPr主要以PEP和EI的有效底物P～His－HPr形式存在。这种HPr的不同形式，直接或间接与CCR有关［3］。其次，P－Ser－HPr能与 CcpA（catabolite control protein A）形成复合物结合到cre（catabolite response elements）上，从而介导碳源降解物激活（carbon catabolite activation，CCA）或CCR。在枯草杆菌和其他革兰阳性菌中，大约10%的基因受CcpA／PSer－HPr调节。此外，P－Ser－HPr还介导非依赖CcpA的CCR机制。还有，P～His－HPr及P～EII还分别正负调控一些含磷酸化作用位点PRD（PTS regulation domain）的反终止因子和转录激活子，从而介导非依赖CcpA的CCR机制［4］。

2 硬壁菌门碳源代谢与毒力的相关关系

在化脓链球菌中，M蛋白是其主要的致病因子，存在于细胞壁，由emm编码，起抗吞噬作用并促进对组织和胞外基质的粘附。当存在包括葡萄糖等几类碳源时，会激发M蛋白的表达。基因emm的上游是基因mga（multiple gene regulator），Mga不仅调控自身的表达和M蛋白，还调控有关细胞粘附、侵袭和免疫逃逸的蛋白［5］。目前已知CcpA能结合在Mga启动子区cre从而介导CCA，通过启动子P1正调控 mga 转录［6］，P－Ser－Hpr很有可能与 CcpA形成复合物参与了这个过程。CcpA正调控mga，与葡萄糖能激发M蛋白合成的现象是一致的［3］。在不同的生长阶段Mga的表达不一样，因此P1会在细菌生长的哪一阶段起作用还未知。化脓链球菌的CcpA除了可能在某一进程通过Mga调控M蛋白，还介导了对链球菌溶血素S（streptolysin S，SLS）的抑制［7］。并且，通过转录组比较，发现CcpA与很多其他毒力因子也相关［8］。除了CcpA，与乳糖PTS组分有关的醛缩酶LacD．1能强烈抑制感染相关基因speB的表达［9］。另外，麦芽糖／麦芽三糖PTS对链球菌在唾液里的生长及在口咽部的定殖起到很重要的作用［10］。最后，在化脓链球菌中，编码 MsmR（multiple sugar metabolism regulators）的基因位于一个含毒力基因的区域，而其中的一些毒力基因确实也是受MsmR控制［11］。

在单增李斯特菌中，Crp／Fnr家族的转录激活子PrfA能够调节多个毒力基因如plcA、plcB、hly、actA、mpl、uhpT 和inlC 的表达［12］，而葡萄糖、果糖、麦芽糖、纤维二糖等能被高效利用的碳源会抑制PrfA的表达。PrfA的表达虽然与CcpA无关，但用枯草杆菌作为异源系统对PrfA的研究显示PSer－HPr的增加能减低PrfA的活性［13］。同时，EI、HPr的失活也会极大削弱PrfA的活性［13］，可见，PrfA的活性有赖于PTS磷酸级联的完整。其次，反应调节蛋白基因ResD的失活会使高效碳源不再抑制一些PrfA调节的毒力基因表达［14］。另外，P～His－HPr磷酸化甘油激酶能够大大增加甘油激酶的活性，而甘油的利用能增加PrfA调节基因的表达［15］，由此可见PTS蛋白与PrfA的联系。

还有很多其他革兰阳性菌的碳源代谢和毒力有联系。产气荚膜梭菌的CcpA影响胶原蛋白酶、孢子生成效率，并与肠毒素基因cpe及荚膜合成相关，且能抑制Ⅳ型菌毛相关的滑移［16］。肺炎链球菌的CcpA与荚膜多糖合成有关，CcpA的失活能使肺炎链球菌毒力的下降，并且CcpA与其在鼻咽部的定殖、肺部的繁殖有关［17］。β－半乳糖苷酶BgaA的生成对肺炎链球菌的粘附和在鼻咽部的定殖很重要，而其受CcpA调控［18］。最后，小鼠肺炎链球菌感染模型的肺部组织能诱导乳糖／纤维二糖PTS和甘露糖 PTS特异性表达［19］。

3 含HprK／P的变形菌碳源代谢与毒力的相关关系

除了革兰阳性菌里有HprK／P，革兰阴性菌里的α、β、γ－变形菌也有 HprK／P［20］。这些革兰阴性菌里有EI、HPr和一两个EIIA，缺乏CcpA、EIIB和EIIC。

在α－变形菌中，hprK 通常邻近ptsH（编码HPr）或编码EIIA的基因，且和毒力或共生相关调节基因在同一操纵子里［3］，这种基因位置的邻近可能预示着毒力与碳源代谢的关系。根瘤土壤杆菌中，chvI－chvG 基因 编码EnvZ／OmpR 双组分系统（two－component system），其缺失后能导致根瘤菌毒力消失［21］，而根瘤菌的hprK 和chvI－chvG 就在同一个操纵子里。其次，除了hprK基因可能和根瘤菌致病相关，乙酰丁香酮等可通过双组分信号传导系统VirA／VirG诱导一系列毒力基因vir的表达。此外，可能属ABC碳源转运系统的葡萄糖／半乳糖结合蛋白ChvE，能通过介导葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖等碳源的趋化和摄取来诱导毒力基因vir的表达，并在细菌趋化性也起作用［22］。牛种布鲁氏杆菌中，BvrR／BvrS双组分系统可能通过与PTS组分相互作用，直接间接影响布鲁杆菌进入胞内微环境的过程［23］。而ptsN和ptsH 的缺失也导致了布鲁杆菌毒力的减弱［24］，如pts相关缺失株显示毒力相关蛋白VirB的生成明显减少［25］。

β－变形菌中，脑膜炎奈瑟氏菌的hprK与果糖EIIA编码基因及yhbJ位于同一操纵子里，而hprK的缺失能导致脑膜炎奈瑟菌粘附细胞的能力明显下降［20］。这种现象的出现可能是因为基因yhbJ在肠杆菌中属于rpoN 操纵子的一部分，能作用于Ⅳ型菌毛合成基因pilE 的－12、－24启动子区［26］。

γ－变形菌中，嗜肺军团菌和铜绿假单胞菌的ptsP缺失株毒力大部分消失，在动物模型和细胞里生长缓慢，而相应的回补株能够使毒力回复，显示这两类菌的毒力与 PTS相关［27－28］。

4 不含HprK／P的变形菌碳源代谢与毒力的相关关系

部分变形杆菌不含HprK／P，其毒力基因的表达通过其他一些碳源代谢机制调控。鼠伤寒沙门氏菌中，去磷酸化EIIBGlc通过控制作用于基因hilE启动子区的转录调节因子 Mlc，抑制hilE从而促进SPI－1（毒力岛I）的基因表达［29］。而基因ptsI（EI编码基因）、cya（腺苷酸环化酶，催化 ATP生成cAMP）、crp（CRP编码基因）的失活均能导致鼠伤寒沙门氏菌在动物模型里毒力的减弱［30］，其中，ptsI的失活影响激活cya表达的P～EIIAGlc生成，因此推断ptsI可能也是通过CRP－cAMP影响细菌毒力。当鼠伤寒沙门氏菌进入肠道，短链脂肪酸能通过BarA－SirA双组分系统诱导SPI－1和SPI－2核心转录激活蛋白hilA的表达［31］。在霍乱弧菌中，CRP－cAMP复合物影响其毒力的表达、密度感应、动力和小肠定殖［32］，其中一部分可能是由CRP－cAMP对核心调节蛋白HapR的CCR作用所致。其次，霍乱弧菌的EI还调节生物膜相关的生长［33］。创伤弧菌的甘露醇代谢与其毒力相关，具体机制未知［34］。伴放线菌聚集杆菌，能致严重的牙周炎，它的白细胞毒素也受CRP－cAMP调节［35］。火疫欧文氏杆菌能使蔷薇科植物患火烧病，而此菌对植物感染的前提是PTS对蔗糖的转运［36］。在假结核耶尔森氏菌里，Csr（carbon storage regulator system）通过RovM调节其毒力调节蛋白RovA，其中，csrC和csrB编码的sRNAs抑制rovA表达，而CsrA抑制RovA的合成［37］。福氏志贺菌的RNA结合蛋白CsrA能促进其糖酵解，而磷酸果糖激酶Pfk1（由pfkA编码）是其糖酵解途径的一个关键酶。csrA、pfkA的失活均能使毒力蛋白IpaB、IpaC产量降低，同时，毒力蛋白Ipa的正调控蛋白编码基因virF、virB 转录水平也降低［38］。

5 放线菌门碳源代谢与毒力的相关关系

放线菌门的结核分枝杆菌是很重要的人类致病菌。在小鼠模型里，结核分枝杆菌在感染的早期需要ABC转运系统对糖醇的转运［39］，后期依赖宿主的脂肪酸作为碳源［40］。结核分枝杆菌编码ABC转运脂肪系统的mce操纵子在体外培养状态表达受抑制［41］，mce操纵子被敲除的结核分枝杆菌在小鼠体内的毒力大大降低［42］，这些预示着碳源代谢与结核分枝杆菌致病有关联。其次，结核分枝杆菌可以在吞噬细胞的吞噬小体里生存，但在吞噬小体里并没有宿主碳源，不过其中有结核分枝杆菌合成分枝菌酸时分泌出胞外的海藻糖，结核分枝杆菌可以利用 ABC 转运系统 LpqY－SugA－SugB－SugC 来逆向转运海藻糖进胞内作为能量来源，而对海藻糖转运的干扰会削弱其毒力［43］。另外，有毒力的牛型结核分枝杆菌，在体外连续传代后，其CRP（Rv3676编码）发生位点突变而失活，这可能致使CRP控制的宿主体内生存相关基因不能表达，使毒力减弱但仍保持免疫原性，从而获得卡介苗（BCG）［44］。

5 小 结

越来越多的证据表明HprK／P及PTS蛋白是碳源代谢与毒力相关连的纽带，革兰阳性菌里的单增李斯特菌和链球菌的P－Ser－Hpr调节毒力基因表达的分子机制比较明确，而革兰阴性菌里HprK／P和PTS蛋白与细菌毒力相关的迹象也越来越多。不过，P－Ser－HPr调控PrfA是在枯草杆菌异源系统里证实的，需要进一步在单增李斯特菌里验证，而葡萄糖对mga的影响也需要在链球菌里进一步确定。除了HprK／P和PTS蛋白，CRP－cAMP也是调节毒力的关键因素，ABC转运系统和双组分系统也可能在碳源代谢与毒力之间起桥梁作用，还有在鼠伤寒沙门氏菌中，Mlc调节SPI－1的途径也已比较明朗。总之，从碳源代谢在细胞代谢中的重要性，不难理解其与细菌毒力的联系，只是其中的机制还不是很清楚，如CRP－cAMP究竟是怎样调控毒力相关基因表达的，鼠伤寒沙门氏菌里的ptsI是不是通过CRP－cAMP影响毒力表达，磷酸化／非磷酸化蛋白如何与转录调节蛋白相互作用等。特别是对于胞内菌如单增李斯特菌、福氏志贺菌、鼠伤寒沙门氏菌和结核分枝杆菌，碳源代谢在体内是不是确实影响毒力基因表达，如何影响，都需要细胞、组织培养及动物模型这些体内实验来进一步确证和积累数据。

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