壳聚糖及其衍生物在胰岛素口服中的应用

杨晓燕，张 娜

(山东大学 药学院 药物制剂研究所，山东 济南 250012)

胰岛素是治疗胰岛素依赖型糖尿病的首选药物，主要采用皮下注射给药。胰岛素口服后易被胃肠道溶解，生物利用度低，因此避免药物失活，促进胰岛素吸收成为提高胰岛素口服生物利用度的关键［1-2］。口服给药系统常用的载体主要是高分子材料和脂质材料，其中天然高分子材料壳聚糖及其衍生物因其优良的性质及其促吸收作用而备受青睐。本文主要对壳聚糖及其衍生物的性质，促吸收机制及其在胰岛素口服中的应用进展进行综述。

1 壳聚糖的性质

壳聚糖由N-乙酰基-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖胺经β(1-4)糖苷键聚合而成，pKa为6.5，在有机酸如醋酸、柠檬酸和谷氨酸中可溶，在中性和碱性条件下不溶。壳聚糖具有生物黏附性，分子中的羟基、氨基可与黏液中带负电荷的糖蛋白形成氢键而产生黏附作用［3］，利于药物的吸收。且壳聚糖具有促渗透吸收性，可以降低细胞间连接ZO-1蛋白的分布，使细胞骨架上F-肌动蛋白由丝状变为球状，可逆的打开细胞间的紧密连接，促进大分子蛋白药物的吸收［4］。因壳聚糖具有上述良好性质，且无毒，生物可降解，而被广泛用作口服蛋白药物的载体［5-8］。

2 壳聚糖在胰岛素口服中的应用

2.1 壳聚糖复合物纳米粒

壳聚糖纳米粒的制备最早采用化学交联剂三聚磷酸钠(TPP)，但TPP为小分子化学试剂，与CS交联的位点有限，限制了其广泛应用。近年来，采用生物相容性阴离子聚合物与壳聚糖形成复合物纳米粒受到了广泛的关注，常用的阴离子聚合物有海藻酸和聚γ-谷氨酸［9］。

2.1.1 海藻酸 酸性条件下，壳聚糖易被溶菌酶降解，与海藻酸形成复合物后，二者之间的强静电力可以抑制溶菌酶对壳聚糖的降解［10］，更好的递送药物。此外海藻酸壳聚糖复合物还具有pH敏感性［11］:在胃酸条件下，海藻酸与壳聚糖形成致密的网状结构，结构稳定，药物释放缓慢;到达小肠后，海藻酸离子化，复合物膨胀疏松，间隙增大，药物释放快。

Sarmento等［11］制备了胰岛素-海藻酸-壳聚糖复合物纳米粒。体外释放显示在pH 1.2的人工胃液中胰岛素缓慢释放，2 h内释放了40%，随后转入pH 6.8的人工肠液，胰岛素快速释放，6 h释放达到70%。糖尿病造模大鼠降血糖试验表明，给药50 U/kg后，血糖百分率在12 h时降至最低为65%，24 h后恢复至最初血糖值，胰岛素口服生物利用度达到 6.8%。

2.1.2 聚 γ-谷氨酸(γ-PGA) γ-PGA为水溶性的多聚阴离子材料，无毒，生物可降解，对胃肠内的消化酶有很好的耐受性［10，12］。Uotani等［12］发现 γ-PGA 口服后可以减慢糖类的吸收，避免血糖升高。Karmaker等［13］也证实了γ-PGA口服后具有降血糖作用。因此采用γ-PGA作为胰岛素口服的载体材料，不仅可以保护胰岛素免受消化酶的降解，还可以与胰岛素协同作用降低血糖。

Sonaje等［14］制备了胰岛素-γ-PGA-壳聚糖自组装纳米粒。体外试验表明纳米粒可以成功的吸附在黏膜表面。糖尿病造模大鼠降血糖试验显示，给药30 U/kg后，血糖百分率在10 h降至最低50%，胰岛素口服生物利用度可以达到15.1%。但是壳聚糖与γ-PGA复合物纳米粒不稳定，为了增加纳米粒的稳定性，制备过程中需要加入交联剂TPP和硫酸镁。

2.2 合并使用促吸收手段

2.2.1 肠溶包衣 为了克服壳聚糖纳米粒在胃酸条件下易解离释放胰岛素的缺陷，可以对壳聚糖纳米粒进行适当保护，如在壳聚糖纳米粒外包裹一层肠溶材料，或将其装入肠溶胶囊。

张力强等［15］制备了胰岛素壳聚糖纳米粒，并采用羟丙甲纤维素酞酸酯进行包衣。体外释放显示，pH 1.2时未包衣纳米粒组胰岛素释放了60%，而包肠溶衣后释放明显降低，10 h内仅释放25%。糖尿病造模大鼠降血糖试验显示，纳米粒组的胰岛素口服生物利用度为11.12%，而包肠溶衣后生物利用度提高至16.29%。Sonaje等［16］制备了胰岛素-γ-PGA-壳聚糖纳米粒，对其进行冷冻干燥得到固体粉末，然后将其装入明胶胶囊。糖尿病造模大鼠降血糖试验显示，纳米粒组的胰岛素口服生物利用度为15.1%，装入胶囊后生物利用度提高至20%。这些研究表明，对纳米粒进行肠溶包衣，可有效地抑制胰岛素的突释效应，并可减少由于壳聚糖溶于胃酸而引发的胰岛素快速释放并被强酸或消化酶破坏失活，进而增加胰岛素的口服吸收，提高口服生物利用度。

2.2.2 壳聚糖-酶抑制剂接枝聚合物 酶抑制剂接枝聚合物，即把酶抑制剂经共价键与不被机体吸收的聚合物如聚丙烯酸酯，壳聚糖等相连，不仅具有黏附性，促渗透吸收性，还具有抑制蛋白酶活性的作用，可以进一步保护胰岛素的活性，提高胰岛素的口服生物利用度。

Werle等［17］用抑肽酶-壳聚糖接枝聚合物包覆降钙素脂质体，用于降钙素口服。体外结果显示，抑肽酶壳聚糖具有蛋白酶抑制活性，且对壳聚糖的黏附性无明显影响。Werle等［18］合成了壳聚糖-抑肽酶接枝聚合物，用其制备胰岛素片剂。结果表明，壳聚糖无酶抑制活性，而抑肽酶接枝后的壳聚糖具有明显的蛋白酶抑制活性。糖尿病造模大鼠降血糖试验显示，接枝聚合物片剂组口服4 h后血糖百分率开始下降，在8 h时降至最低84%;而壳聚糖片剂组口服后无降糖作用，在8 h时血糖百分率为120%。结果表明抑肽酶接枝到壳聚糖上后仍具有蛋白酶抑制活性，可以保护胰岛素的活性，利于胰岛素的吸收。然而其长期使用是否存在毒性等安全问题还需要进一步研究。

3 壳聚糖衍生物在胰岛素口服中的应用

对壳聚糖进行衍生化，增加其在中性和碱性条件下的溶解性，制备多功能聚合物成为近年来的研究热点［19］。近年来研究的壳聚糖衍生物主要有下列几种。

3.1 N-三甲基壳聚糖(N-Trimethyl-Chitosan，TMC)

壳聚糖的伯胺基经碘代甲烷取代即得TMC。TMC在pH 1～9均可以溶解［20］。三甲基的引入，增加了分子的空间位阻，使壳聚糖的黏附性降低，但黏附性仍大于其他聚合物如果胶等［21］。TMC促吸收作用与季氨化程度(DQ)有关。中性条件下，低DQ(12%)的TMC不具有促吸收作用，DQ升高，TMC的促吸收效果越显著［20］。

Sadeghi等［22］采用TMC(DQ为50%)制备了胰岛素-TMC复合物纳米粒。Caco-2细胞试验显示，TMC组中胰岛素的细胞间转运量比壳聚糖组增加了一倍，具有更好的促吸收效果。Sandri等［23］对TMC的促渗透吸收性进行了体外研究，离体器官的渗透性试验显示，在十二指肠(pH 5.0～5.5)内，壳聚糖与TMC均具有很好的渗透吸收性，在空肠(pH 6.0～6.5)内，TMC比壳聚糖具有更好的渗透性。增加壳聚糖在中性条件下的溶解性可以增加其促吸收效果，但体内的降糖效果还需要进一步的验证。

3.2 PEG 化壳聚糖

对壳聚糖进行PEG化修饰，可以增加其生物相容性。载药的PEG-壳聚糖纳米粒内部为包载的药物，外部是由PEG链形成的“冠”状结构，此结构可以增加粒子的亲水性，避免粒子的聚集，利于粒子在小肠的转运，且研究表明PEG本身不具备黏附性，但是其可以与黏膜黏液层相互渗透，促进黏附过程的发生，是一种很好的黏附启动因子［24］。Prego等［25］制备了载降钙素的PEG-壳聚糖纳米粒，纳米粒的毒性明显降低。Jintapattanakit等［24］制备了胰岛素-PEG-TMC复合物纳米粒，其黏附性比胰岛素-TMC复合物纳米粒增加了3.4倍。结果表明对壳聚糖及其衍生物进行PEG化，可以增加生物相容性和黏膜黏附性。

3.3 硫醇化壳聚糖

近年来硫醇化聚合物在蛋白药物口服中的应用中受到了广泛的关注。其优势有是硫醇化聚合物与胃肠黏膜表面的半胱氨酸形成二硫键，使粒子在黏膜处锚定;硫醇化聚合物分子内部形成二硫键，增加纳米粒的稳定性。巯基化合物与壳聚糖伯胺基共价连接即得硫醇化壳聚糖。经硫醇化修饰后，壳聚糖的黏附性增加，游离巯基越多，黏附性越强。有研究表明，硫醇化壳聚糖片剂比壳聚糖片剂在肠内的滞留时间增加［26］。

Yin等［27］分别采用硫醇化程度为15%和30%的TMC-半胱氨酸(TMC-Cys)制备载胰岛素纳米粒。Caco-2细胞结果显示TMC-Cys纳米粒组的黏附性比TMC纳米粒组增加了2.1～4.7倍，且硫醇化程度大，黏附性越强。糖尿病造模大鼠降血糖试验显示，TMC纳米粒组与TMC-Cys纳米粒组分别口服给药50 U/kg后，前者在1.5 h时血糖百分率降至最低为70%，8 h后恢复最初血糖水平，而后者在2 h时降至最低为30%，8 h后仍有降糖效果。表明硫醇化修饰后的壳聚糖纳米粒黏附性增强，在黏膜的滞留时间增加，利于胰岛素的吸收，从而延长了降糖持续时间。

3.4 邻苯二甲酸壳聚糖

壳聚糖的伯氨基经邻苯二甲酸的羧基取代即可得到邻苯二甲酸壳聚糖。在酸性条件下，邻苯二甲酸壳聚糖的羧基以-COOH存在，亲水性弱，纳米粒致密，药物释放缓慢;碱性条件下，羧基离子化，亲水性增强，纳米粒膨胀，利于药物的释放。Ubaidulla等［28］制备了载胰岛素邻苯二甲酸壳聚糖纳米粒，体外释放显示，在pH 2.0的人工胃液中，胰岛素释放缓慢，2 h内仅释放20%，随后转入pH 7.4的人工肠液，胰岛素快速释放，6 h时胰岛素释放了70%，在10 h释放完全。糖尿病造模大鼠体内降糖实验显示，修饰的壳聚糖纳米粒在2 h内无降血糖作用，6 h时降血糖作用最显著，血糖百分率降至最低51.54%，16 h时仍具有降糖作用。

3.5 十二烷基琥珀酰壳聚糖

中链的脂肪酸及其钠盐如辛酸盐，葵酸盐和月桂酸盐，可以与细胞间连接的钙离子螯合，扰乱分子的结构，打开细胞间的紧密连接，促进亲水性药物的吸收［29］，同时钙离子也是蛋白水解酶发挥活性的必需金属离子，因此脂肪酸还有降低蛋白水解酶的活性，保护蛋白的作用［30］。采用脂肪酸对壳聚糖进行修饰，可以保护胰岛素的活性，进一步增加亲水药物的细胞间转运，促进药物的吸收。

Rekha等［30］分别制备了载胰岛素壳聚糖纳米粒和载胰岛素十二烷基琥珀酸壳聚糖纳米粒，并对其进行了体内外研究。Caco-2细胞试验显示，十二烷基琥珀酸壳聚糖纳米粒能更加明显地降低细胞间阻滞，促进胰岛素的细胞间转运。糖尿病造模大鼠降血糖试验显示，壳聚糖纳米粒组与十二烷基琥珀酸壳聚糖纳米粒组分别给药60 U/kg后，前者在3 h时血糖百分率降至最低为83%，7 h后无降糖效果，而后者在3 h时降至75%，6 h时降至最低70%，7 h后仍有降糖效果。

4 结论

壳聚糖及其衍生物具有生物相容性，生物黏附性和促渗透吸收性［7］，在胰岛素口服中显示了良好的应用前景。其中硫醇化壳聚糖和pH敏感壳聚糖衍生物显示了很好的效果。前者经共价键作用增加黏膜黏附性，更有效递送药物，增加肠吸收;后者控制释药，保证药物的活性，显示了良好的吸收效果，但目前还未有上市的胰岛素口服制剂。要想提高胰岛素的口服吸收生物利用度，需要解决胰岛素的不稳定、黏膜渗透性差等问题。制备多功能的壳聚糖纳米粒，使其不仅可以抑制胰岛素在胃内的释放，控制胰岛素在肠内的释放，同时又具有生物黏附性，促渗透吸收性和酶抑制性等性质，可以达到增加胰岛素口服吸收，提高口服生物利用度的目的。

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