叶酸受体介导的靶向给药系统研究进展

张 林，刘秀菊，于爱华，翟光喜

(1.山东大学 药学院，山东 济南 250012;2.山东省立医院(西院)药剂科，山东 济南 250022)

肿瘤发病率逐年攀升，已经成为严重影响人类健康的常见疾病。化疗作为肿瘤治疗的手段之一，在恶性肿瘤的治疗过程中发挥着不可替代的作用。传统抗癌药物的主要缺点在于抑制肿瘤细胞生长的同时也抑制了正常细胞的增殖从而引起严重的副反应，因而药物的靶向治疗引起人们的关注［1-2］。叶酸受体(folate receptor，FR)介导的靶向给药系统是利用肿瘤细胞和正常细胞表面FR表达的差异性，特异性结合肿瘤细胞表面高表达的FR，来实现叶酸结合物的靶向传递，从而减少药物治疗癌症时对正常细胞的损害［3］，是目前药物靶向运输的研究热点［4-5］。本文就近年来FR介导的靶向给药进行了综述。

1 叶酸和FR

叶酸作为水溶性维生素B家族中的成员之一，存在于许多蔬菜中，最初由菠菜中分离得到［6］。由于叶酸相对分子质量(Mr)小、易于修饰和穿透肿瘤细胞、免疫原性低，因而具有到达靶点时间短、血液清除速度快、穿透力强、人体免疫反应低等优点［7-8］。

FR是一种糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol，GPI)连接的膜糖蛋白，Mr为38 000～40 000，是可以介导细胞内吞，将叶酸摄入真核细胞胞浆的一种高亲和力受体［9］。FR在某些肿瘤细胞表面高度表达，而在正常组织无或很少表达，因而具有良好的肿瘤组织特异性。近年来FR在药物靶向运输、癌症及风湿性关节炎的免疫疗法等领域中的研究受到广泛关注。

FR有三种异构单体:FRα、FRβ 和FRγ［9］。FRα 在卵巢癌［10］、结直肠癌［11］、子宫内膜癌、睾丸癌、脑瘤、肺腺癌等上皮细胞系肿瘤中高水平表达。由于在正常组织和同种来源的肿瘤组织中表达水平有显著性差异，后者的表达水平比前者几乎高出2个数量级;FRβ经常高表达于非上皮组织来源的肿瘤细胞表面，如肉瘤和急性髓细胞白血病，FRβ成为FR介导的髓细胞白血病靶向治疗的潜在靶标［9］;FRγ在正常的血清中检测不到，可以作为淋巴瘤中血清标记物［12］。

2 FR介导的靶向给药机制

FR介导的靶向给药系统常以叶酸或叶酸类似物为载体，将放射性核素、抗肿瘤药物、基因药物与之偶联，实现靶向输送药物的作用。常用的叶酸类似物主要有:5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、磺胺、甲氨蝶呤、5，10-亚甲基四氢叶酸等［13］。

FR在肿瘤细胞表面高度表达，而在正常组织中的表达却高度保守。基于这种表达差异，可以实现叶酸-药物偶联物的主动靶向运输。叶酸-药物偶联物与肿瘤细胞表面的叶酸受体特异性结合后，形成叶酸-药物与FR复合物，通过内吞作用进入肿瘤细胞形成独立的内吞体。由于离子泵的作用使内吞体的pH值由7下降到5，叶酸-药物与FR复合物的构象改变，药物解离下来，进入细胞内，而FR重新回到细胞表面，循环转运药物［9］。研究表明，癌细胞表面FR的表达数目直接影响到叶酸-药物复合物与之结合并内吞的数目，一般来说，一个癌细胞每1 h大约能够内吞(1～2)×105个叶酸-药物复合物分子［14］。因此，可以利用这种内吞作用进行肿瘤的靶向治疗研究。

3 FR介导的靶向给药常用载体

FR靶向制剂在肿瘤显像和标识、基因治疗、免疫治疗、关节炎治疗及药物靶向传递中发挥着重要作用［15-17］。其中由叶酸介导的药物靶向运输载体主要有两类。一类是叶酸-分子复合物如叶酸-蛋白毒素，但是由于多数叶酸复合物的体积较大，不易达到肿瘤细胞和被肿瘤细胞摄取，故常用纳米级的叶酸偶联物作为叶酸受体介导的靶向给药载体，如脂质体、胶束、纳米粒、乳剂、树枝状聚合物、超分子囊泡状聚合物等。

3.1 脂质体

传统脂质体载药技术因缺乏主动识别过程，其组织选择性低，靶向性不理想。叶酸脂质体作为抗癌药物主动靶向载体，除具有一般脂质体的共同特点外，还显示出良好的肿瘤细胞主动靶向性［18］。

脂质体表面用聚乙二醇(PEG)修饰可以增加脂质体的稳定性、延长循环时间［19-20］，叶酸修饰的脂质体可以扩大可接受的配体范围，提高对肿瘤组织的靶向性。Wu等［21］制备的叶酸修饰PEG化紫杉醇脂质体，不仅能够降低处方中聚氧乙烯蓖麻油带来的毒性、延长循环时间，而且还可以靶向FR过度表达的肿瘤细胞。小鼠体内的药代动力学试验显示，靶向PEG化的紫杉醇脂质体与非靶向PEG化紫杉醇脂质体的血浆半衰期分别为12.33和14.23 h，而以聚氧乙烯蓖麻油为佐剂的游离紫杉醇注射制剂的血浆半衰期为1.78 h，说明PEG的引入使得脂质体的循环时间延长。靶向PEG化的紫杉醇脂质体的血浆清除率(0.75mL/h)大于非靶向PEG化紫杉醇脂质体的血浆清除率(0.41mL/h)，说明经叶酸修饰的脂质体能够快速被肿瘤细胞摄取。另外，体外对人口腔癌细胞的细胞毒性试验表明，叶酸修饰的紫杉醇脂质体比非靶向的脂质体毒性高3.8倍，说明该制剂能有效地靶向肿瘤细胞。

闫颖等［22］制备了一种FR靶向的阳离子脂质体，以荧光素标记的阴离子葡聚糖(DFA)为模型药物，并加入长循环修饰剂PEG，使得脂质体具备肿瘤靶向和长循环双重作用。用细胞表面高表达FR的鼻咽癌细胞(KB)和低表达FR的肝癌细胞(HepG2)进行了细胞摄取率评价，流式细胞仪检测KB细胞和HepG2细胞对DFA脂质体的摄取，结果表明FR靶向的长循环阳离子脂质体能提高细胞对脂质体包载药物的摄取。体外细胞转染试验结果显示，与游离药物溶液相比叶酸-PEG脂质体和PEG脂质体对HepG2细胞的转染率分别从0.29%上升到23.27%和20.16%;KB细胞的转染率分别从0.05%上升到84.78%和81.90%，说明脂质体经叶酸修饰后肿瘤细胞靶向作用增强，并且FR高表达的肿瘤细胞对叶酸修饰脂质体包载药物的摄取率较高。

3.2 胶束

通过对胶束进行叶酸修饰可以有效地靶向肿瘤细胞，提高肿瘤细胞的杀伤能力。常用于叶酸修饰形成胶束的材料有生物可降解的材料聚乳酸及其共聚物［3］、聚合物材料等。

Han等［23］以难溶性药物9-硝基喜树碱(9-NC)为模型药物，以叶酸-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(Folate-PEGDSPE)与甲氧基-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(MPEGDSPE)比例为1∶100的共聚物为载体材料，比较了9-NC叶酸共聚物胶束(Folate-M-9-NC)、不含叶酸的载药胶束M-9-NC和游离药物的体外药效学。结果显示，不同肿瘤细胞对药物的敏感性不同，叶酸共聚物胶束更能增强药物对FR高表达肿瘤细胞的杀伤能力。另外，有研究表明，叶酸靶向的聚乳酸类胶束载体也具有良好的肿瘤靶向性和实用性［24］。曹俊等［25］制备了一种新型的叶酸偶联羟脯氨酸-乳酸共聚物(PLLA-PHpr-Folate)胶束，以油溶性药物β-胡萝卜素为模型药物。共聚物胶束对β-胡萝卜素的包载能力较大，载药量恒定，认为该胶束有作为疏水性药物载体的能力，在肿瘤的靶向治疗上有广阔前景。

通过形成一个二元的肿瘤靶向系统如叶酸靶向和磁靶向相结合可以使靶向性更精确［26］。Yang等［27］合成了叶酸修饰的超顺磁Fe3O4载多柔比星聚合物胶束(SPIO-DOXLoaded micelles)。其中叶酸可以与肿瘤细胞表面过度表达的FR特异性结合从而靶向肿瘤部位，另外通过提供外部磁场的作用可以使得胶束顺利到达肿瘤部位发挥治疗作用。

3.3 纳米粒

以白蛋白、聚合物、乙酰化的多糖等为载体制备的叶酸修饰纳米粒具有靶向运输药物的作用。张良珂等［28］制备了叶酸偶联米托蒽醌白蛋白纳米粒(MTO-BSANP-folate)，考察了其与米托蒽醌白蛋白纳米粒及米托蒽醌溶液相比、对荷SKOV3人卵巢瘤细胞裸鼠肿瘤生长的影响。结果表明MTO-BSANP-folate的抑瘤率为84.53%，明显大于米托蒽醌白蛋白纳米粒及米托蒽醌溶液的抑瘤率。

利用不同聚合物性质将两种聚合物掺杂在一起，一方面起到FR靶向的作用，另一方面可以达到疏水-亲脂的平衡。Pan等［29］通过改变聚乳酸-D-α生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(PLA-TPGS)和TPGS-COOH两个聚合物的比例，制备叶酸修饰的共聚物纳米粒以达到肿瘤细胞靶向的作用。其中TPGS-COOH易于被叶酸修饰，可以靶向肿瘤细胞表面的FR，PLA-TPGS则是用来调节疏水-亲脂的平衡。

普鲁兰多糖(PA)是一种具有良好生物相容性的水溶性多糖，其无毒、无免疫原性的特点使其成为一种新型的纳米载体。张慧珠等［30］将普鲁兰多糖乙酰化使其疏水性增加，然后通过酯化反应与叶酸偶联，成为叶酸修饰的乙酰普鲁兰纳米粒(Folate-PA)。以盐酸表阿霉素(EPI)为模型药物，采用激光共聚焦显微镜观察PA/EPI及Folate-PA/EPI纳米粒在人口腔癌细胞的摄取情况，结果表明，后者进入细胞主要通过叶酸受体介导途径，而前者进入细胞与FR无关。因此，这种新型材料制备的纳米粒是一个很有发展前途的靶向运输药物的载体。

此外，量子点技术的应用可以在体外通过荧光显微镜对靶向癌细胞的药物载体造影，清楚地观察到纳米粒对癌细胞的靶向性［31］。Mathew等［32］将叶酸修饰的羧甲基壳聚糖与锰、硫化锌掺杂的量子点造影剂装载到一块制备纳米粒(Folate-CMC-ZnS:Mn)，以5-氟脲嘧啶为模型药物研究其对乳腺癌细胞系MCF-7细胞的靶向性和细胞毒性。研究结果显示，Folate-CMC-ZnS:Mn对鼠成纤维细胞L929没有毒性，而载药的纳米粒对MCF-7细胞有明显毒性，说明此纳米粒可以选择性靶向于肿瘤细胞。

3.4 乳剂

Kim等［33］制备了叶酸修饰的乳剂。以全反式维A酸(ATRA)为模型药物，制备了不同Mr的PEG的两种叶酸修饰的乳剂(folate-tethered-emulsion，FTE)ATRA-FTE2000/3400，并与非叶酸修饰的乳剂(non-tethered-emulsion，NTE)ATRANTE的细胞摄取率及对人口腔癌KB细胞的生长抑制活性进行了比较。结果显示，ATRA-FTE3400、ATRA-FTE2000分别使ATRA的细胞摄取率增加3倍和1.6倍，在FR表达较高的KB细胞中，ATRA对KB细胞的生长抑制活性顺序为:ATRA-FTE3400＞ATRA-FTE2000＞ATRA-NTE。结果显示，PEG的Mr影响制剂的靶向性，叶酸修饰的乳剂不仅增加了ATRA的细胞摄取率并对肿瘤细胞的活性抑制作用增强，说明叶酸修饰的乳剂是靶向运输抗肿瘤药物的良好载体。

3.5 树枝状聚合物

树枝状聚合物(dendrimer)，是一种人工合成的新型纳米级材料，因具有树枝状的分支结构而得名，近年来关于其靶向给药的研究日益增多［34-35］。叶酸修饰的树枝状聚合物，能够靶向于关节炎部位，达到有效治疗关节炎的作用。Chandrasekar等［36］以吲哚美辛为模型药物制备了叶酸修饰的聚乙二胺树枝状聚合物，合成了含不同叶酸分子的聚合物，结果表明叶酸含量越高，载药量和包封率就越高。以关节炎大鼠为病理模型，腹腔注射给药，尾静脉取血进行药代动力学试验，结果显示含有21个叶酸分子的处方的AUC最大，说明该处方靶向治疗关节炎的效果良好。

3.6 超分子囊泡状聚合物

超分子囊泡状聚合物(SVAs)是由磷脂和聚合物材料(PLA，PEG等)形成的具有生物相容性的胶体囊泡状载体。Licciardi等［37］制备了叶酸修饰的超分子囊泡状聚合物(Folate-SVAs)，以吉西他滨为模型药物。人乳腺癌细胞(MCF-7)毒性试验表明，与游离药物、载药脂质体及无叶酸修饰的SVAs相比，Folate-SVAs的抗癌活性显著增加。大鼠尾静脉注射游离吉西他滨、载药SVAs、载药Folate-SVAs后药代动力学参数显示，与游离药物的血浆t1/2(1.1 h)相比，载药SVAs、载药 Folate-SVAs的血浆 t1/2分别增加到 4.5 和4.6 h，说明SVAs能较好延长药物的作用时间，但是Folate-SVAs的t1/2以及Cmax、Vd等药动学参数与SVAs比较，无显著性差异，这可能由于Folate-SVAs所特有胶体表面性质能够增加其立体障碍使得其各项参数与SVAs相比无显著性差异。从上述试验可以看出，只有细胞毒性试验结果说明Folate-SVAs可以作为药物靶向运输载体的理由还不够充分。因此，Folate-SVAs作为靶向给药载体有待于进一步研究。

4 展望

鉴于FR在多种癌细胞表面特别是上皮组织恶性肿瘤表面高表达的特性，它在鼻咽癌、肺癌、结肠癌、胃癌及妇科肿瘤等癌症的靶向治疗中发挥着重要作用［38-39］。FR介导的靶向给药系统通过与肿瘤细胞表面过度表达的FR特异性结合，可以提高药物对靶标的毒性、降低药物的副作用。但目前对于该类靶向给药系统的靶向性评价大多是根据体外的细胞毒性试验和细胞摄取率试验进行的，动物体内试验数据相对缺乏，在人体内的靶向治疗作用尚需进一步研究。

［1］傅刘鹏，徐 俊，黄思超，等.叶酸脂质体对乳腺癌4T1细胞的体内靶向性研究［J］.山东医药，2010，50(7):23-25.

［2］Aluri S，Janib S M，Mackay J A.Environmentally responsive peptides as anticancer drug carriers［J］.Adv Drug Deliv Rev，2009，61(11):940-952.

［3］万伟伟，朱 宏.叶酸修饰的聚乳酸及其共聚物靶向给药系统研究进展［J］.中国生化药物杂志，2010，31(4):285-289.

［4］Shmeeda H，Amitay Y，Gorin J，etal.Delivery of zoledronic acid encapsulated in folate-targeted liposome results in potent in vitro cytotoxic activity on tumor cells［J］.J Controlled Release，2010，146(1):76-83.

［5］涂 松，李文龙，陈元维，等.叶酸受体靶向星形聚己内酯纳米胶束的制备和性质［J］.中国组织工程研究与临床康复，2010，14(12):2149-2152.

［6］Tyagi A，Penzkofer A.Fluorescence spectroscopic behaviour of folic acid［J］.Chem Phys，2010，367:83-92.

［7］Moore J L.The significance of folic acid for epilepsy patients［J］.Epilepsy Behav，2005，7(2):172-181.

［8］Lazarou C，Kapsou M.Therole of folic acid in prevention and treatment of depression:an overiew of existing evidence and implications for practice［J］.Complement Ther Clin Pract，2010，16(3):161-166.

［9］Leamon C P，Reddy J A.Folate-targeted chemotherapy［J］.Adv Drug Deliv Rev，2004，56(8):1127-1141.

［10］Kalli K R，Oberg A L，Keeney GL，etal.Folate receptor alpha as a tumor target in epithelial ovarian cancer［J］.Gynecol Oncol，2008，108(3):619-626.

［11］Shia J，Klimstra D S，Nitzkorski J R，etal.Immunohistochemical expression of folate receptor alpha in colorectal carcinoma:patterns and biological significance［J］.Hum Pathol，2008，39(4):498-505.

［12］Elnakat H，Ratnam M.Distribution，functionality and gene regulation of folate receptor isoforms:implications in targeted therapy［J］.Adv Drug Deliv Rev，2004，56(8):1067-1084.

［13］Reddy JA，Westrick E，Vlahov L，etal.Folate receptor specific anti-tumor activity of folate-mitomycin conjugates［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2006，58(2):229-236.

［14］Lu Y J，Low P S.Folate-mediated delivery of macromolecular anticancer therapeutic agents［J］.Adv Drug Deliv Rev，2002，54(5):675-693.

［15］Chango A，Nour A A，Bousserouel S，etal.Time course gene expression in the one-carbon metabolism network using HepG2 cell line grown in folate-deficient medium［J］.J Nutr Biochem，2009，20(4):312-320.

［16］Prabaharan M，Grailer J J，Pilla S，etal.Folate-conjugated amphiphilic hyperbranched block copolymers based on Boltorn H40，poly(L-lactide)and poly(ethylene glycol)for tumor-targeted drug delivery［J］.Biomaterials，2009，30(16):3009-3019.

［17］Zheng Y，Song X R，Darby M，etal.Preparation and characterization of folate-poly(ethylene glycol)-grafted-trimethylchitosan for intracellular transport of protein through folate receptor-mediated endocytosis［J］.J Biotechnol，2010，145(1):47-53.

［18］Andresent T L，Jensen S S，Jogensen K.Advanced strategies in liposomal cancer therapy:problem and prospects of active and tumor specific drug release［J］.Prog Lipid Res，2005，44(1):68-97.

［19］Lee R J，Low PS.Folate-mediated tumor cell targeting of liposomeentrapped doxorubicin in vitro［J］.Biochim Biophys Acta，1995，1233(2):134-144.

［20］孙 萍，邓树海，于维萍.PEG修饰大蒜素长循环脂质体的制备工艺研究［J］.山东中医药大学学报，2007，31(5):415-417.

［21］Wu J，Liu Q，Lee R J.A folate receptor-targeted liposomal formulation for paclitaxel［J］.Int J Pharm，2006，316(1-2):148-153.

［22］闫 颖，齐宪荣.以叶酸受体为靶向的阳离子脂质体的制备与性质考察［J］.药学学报，2008，43(11):1134-1139.

［23］Han X，Liu J，Liu M，etal.9-NC-loaded folate-conjugated polymer micelles as tumor targeted drug delivery system:preparation and evaluation in vitro［J］.Int J Pharm，2009，372(1-2):125-131.

［24］Yoo H S，Park T G.Folate receptor targeted biodegradable polymeric doxorubicin micelles［J］.J Controlled Release，2004，96:273-283.

［25］曹 俊，吴 瑶，陈元维，等.叶酸受体靶向的聚乳酸共聚物胶束的制备及性质研究［J］.功能材料，2010，41(3):418-424.

［26］胡 艳，徐维平，李 婧，等.甲氨蝶呤叶酸受体-磁双重靶向纳米粒的制备及评价［J］.中国新药杂志，2009，18(24):2370-2373.

［27］Yang X Q，Chen Y H，Yuan R X，etal.Folate-encoded and Fe3O4-loaded polymeric micelles for dual targeting of cancer cells［J］.Polymer，2008，49:3477-3485.

［28］张良珂，候世祥，卢 懿，等.叶酸受体介导米托蒽醌白蛋白纳米粒的体内分布及药效学研究［J］.中国药学杂志，2007，42(9):676-678.

［29］Pan J，Feng SS.Targeted delivery of paclitaxel using folate-decorated poly(lactide)-vitamin E TPGSnanoparticles［J］.Biomaterials，2008，29(17):2663-2672.

［30］张慧珠，张其清.叶酸靶向乙酰普鲁兰纳米粒的制备及其靶向作［J］.高等学校化学学报，2009，30(6):1146-1151.

［31］傅晓源，陈富韬，张浩伟，等.量子点在叶酸偶联白蛋白纳米粒靶向肿瘤细胞研究中的应用［J］.中国现代医学杂志，2008，18(23):3418-3420.

［32］Mathew M E，Mohan J C，Manzoor K，etal.Folate conjugated carboxymethyl chitosan-manganese doped zinc sulphide nanoparticles for targeted drug delivery and imaging of cancer cells［J］.Carbohydr Polym，2010，80:442-448.

［33］Kim SH，Kim J K，Lim SJ，etal.Folate-tethered emulsion for the target delivery of retinoids to cancer cells［J］.Eur J Pharm，2008，68(3):618-625.

［34］Okuda T，Kawakami S，Akimoto N，etal.PEGylated lysine dendrimers for tumor-selective targeting after intravenous injection in tumor-bearing mice［J］.J Controlled Release，2006，116(3):330-336.

［35］Kaminskas L M，Kota J，Mcleod V M，etal.PEGylation of polylysine dendrimers improves absorption and lymphatic targeting following SC administration in rats［J］.J Controlled Release，2009，140(2):108-116.

［36］Chandrasekar D，Sistla R，Ahmad F J，etal.The development of folate-PAMAM dendrimer conjugates for targeted delivery of anti-arthritic drugs and their phamacokinetics and biodistribution in arthritic rats［J］.Biomaterials，2007，28(3):504-512.

［37］Licciardi M，Paolino D，Celia C，etal.Folate-targeted supramolecular vesicular aggregates based on polyaspartyl-hydrazide copolymers for the selective delivery of antitumoral drugs［J］.Biomaterials，2010，31(28):7340-7354.

［38］Cavallaro G，Mariano L，Salmaso S，etal.Folate-mediated targeting of polymeric conjugates of gemcitabine［J］.Int J Pharm，2006，307(2):258-269.

［39］张淑芳，胡喜钢，曹漫明，等.叶酸-葡聚糖-盐酸吡柔比星偶联物对人胃癌SGC-7901细胞的靶向作用［J］.山西医药杂志，2007，36(3):200-202.