阿卡波糖的研究进展

张瑞霞，杨凤英，卓文海，徐宝兴

(山东鲁抗医药股份有限公司，山东 济宁 272000)

20世纪70年代以来，糖尿病、高血糖等糖代谢疾病发病人数迅速增加，目前糖尿病已经被列为继心血管、肿瘤之后的第三大致死性疾病，严重威胁着人类健康。糖尿病对生活质量的影响和巨大的医疗开支，促进了全社会对糖尿病的重视和对其多种治疗手段的深入研究［1］。

阿卡波糖(Acarbose)是临床常用的α－葡萄糖苷酶抑制剂，属于2型糖尿病的常用药物之一，它是一种生物合成的假性四糖，能抑制小肠壁细胞的α－糖苷酶活性，从而延缓肠道内寡糖、双糖或多糖的降解，延缓葡萄糖和果糖的降解和吸收，以达到降低餐后血糖的效果［2］。由于具有良好的药代动力学性质和低毒性，阿卡波糖成为理想的降糖药物，本文从发酵、分离以及衍生物研究等方面对阿卡波糖的研究进展进行综述。

1 阿卡波糖的发酵工艺研究

由于阿卡波糖的化学结构比较复杂，目前工业规模的生产主要是通过微生物发酵获得的。阿卡波糖可从游动放线菌的发酵液中提取得到，其在微生物体内的合成代谢路径以及发酵工艺研究一直是阿卡波糖的研究热点之一。

1.1 碳源浓度的影响 阿卡波糖分子具有假性四糖结构，这表明其生物合成与碳源物质的分解代谢有着密切的关系，碳源浓度过高或过低都会影响菌体的生长和代谢，进而通过代谢物阻遏效应降低产物的浓度，影响微生物的正常生理代谢。因此，优化培养基中碳源的组成，对提高阿卡波糖的产量有重大的影响。

Choi BT等［3］在研究游动放线菌CKD－485－16发酵产阿卡波糖的过程中发现，葡萄糖和麦芽糖既是阿卡波糖的能源物质又是其合成的前体物质，葡萄糖在发酵早期就被耗尽，而麦芽糖在整个发酵过程中缓慢地被利用，并且在葡萄糖耗尽之后，充当能源物质。同时，因为麦芽糖会直接掺入阿卡波糖的结构中，所以葡萄糖在早期耗完之后，后期麦芽糖含量减少会显著制约阿卡波糖的产量，因此必须严格控制葡萄糖的含量并保持麦芽糖在发酵液中的高浓度来促进阿卡波糖的合成。

程新等［4］人的研究结果表明，当发酵培养基和补料培养基中的碳源选用麦芽糖和葡萄糖，且其配比分别为3∶1和4∶1时，最利于阿卡波糖的合成。在游动放线菌A－5.6发酵过程中通过碳源的选择和补加，使发酵液的总糖浓度保持在合适的水平，可以大幅提高阿卡波糖的产量。

叶亚健等［5］对阿卡波糖产生菌游动放线菌A－5.6的发酵进行了研究，并进行了30 m3罐发酵放大。通过摇瓶分批补料发酵，表明补料培养基中麦芽糖和葡萄糖配比对阿卡波糖的合成具有显著的影响，且麦芽糖和葡萄糖的配比为3∶1最利于阿卡波糖合成;在此基础上，在100 L发酵罐上进一步考察了碳源对阿卡波糖发酵的影响，结果表明，补料阶段的发酵液总糖和还原糖浓度分别控制在75～80g·L－1和45～50g·L－1时，最利于阿卡波糖合成。

1.2 氮源浓度的影响 张琴等［6］通过对游动放线菌LAH6采用紫外、亚硝基胍、硫酸二乙酯和亚硝酸等方法进行诱变，筛选到一株高产突变株SIPI－AK，且杂质含量明显降低，通过进一步优化发酵培养基和10 L发酵罐的补料工艺，发酵单位达到3130 μg·mL－1。该研究同时发现阿卡波糖的生物合成与补料培养基中氮源的种类和比例有密切关系，在发酵过程中补入谷氨酸钠并维持一定含量，不仅能大幅提高阿卡波糖的发酵单位，还能适当降低杂质C组分的产生，此补料工艺可供工业生产提高阿卡波糖发酵水平做参考。

1.3 渗透压的影响 在阿卡波糖的发酵过程中，渗透压对其产量有着决定性的作用。一方面由于在阿卡波糖的生物合成中麦芽糖可直接掺入阿卡波糖的分子结构中，提高培养液的渗透压，可促进麦芽糖向细胞内运输，从而提高阿卡波糖的产率;另一方面，碳源浓度过高会使培养基的渗透压过高，影响菌体的生长和代谢，产生分解代谢物阻遏效应，降低产物的浓度。因此，在发酵过程中，要严格控制培养基的组成及渗透压。

Beunink J等［7］利用游动放线菌 SE50/10合成阿卡波糖，发现阿卡波糖的产量与培养液的渗透压有着密切的关系。最适宜的渗透压值为400 mOsm·kg－1，高于或低于该值，阿卡波糖的产量都会下降，渗透压过高或过低时，甚至没有阿卡波糖的生成。一般情况下低渗透压不会对微生物的生长及代谢造成严重影响，但是却能严重影响阿卡波糖的合成。

1.4 用阿卡波糖的类似物抑制阿卡波糖向副产物组分C的转化 在合成阿卡波糖的同时，还会形成一系列阿卡波糖的同系物，如组分A、组分C等，药典对这些杂质的含量有着严格的限制，因此如果能够降低发酵液中副产物的含量，将大幅降低阿卡波糖临床用药的生产成本。

发酵液中副产物组分A和C是由阿卡波糖直接转化而来的，其分子结构与阿卡波糖非常相似，不仅影响阿卡波糖的产率而且增加了阿卡波糖纯化的难度。因此，多年来，人们积极寻求新的措施来减少阿卡波糖向组分A和C的转化。最近的研究表明［8］，在Actinoplanes sp.内组分C的形成是阿卡波糖在海藻糖合成酶(TreY)的异构化作用下产生的，由于在细胞内还存在另外的海藻糖合成途径，如TreS和TpS1，因此如果将TreY定点突变，则可以在不影响细胞对海藻糖的利用的情况下大幅降低组分C的含量。

此外，研究还发现［9］，在游动放线菌的发酵液中存在一系列的阿卡波糖类似物，由于与阿卡波糖的结构相似，所以可充当催化这一转化反应的酶的竞争性抑制剂，并且都显示了明显的抑制作用。在以游动放线菌CKD－485－16作阿卡波糖产生菌时，加入抑制剂可以明显的降低组分C的含量，使阿卡波糖的产量得到显著提高。据报道［10］，如果在发酵早期加入微量的阿卡波糖竞争性抑制剂，可以使组分C的含量减少31%～92%。

2 阿卡波糖的分离工艺研究

近年来，对阿卡波糖提取工艺的研究报道日益增多。九十年代国外一般用树脂进行分离提取，利用阿卡波糖结构中一个－NH－基所表现出弱碱性的特点，可利用离子交换树脂对其进行分离纯化;Lin CL等［11］的报道中提出利用阿卡波糖在乙醇中沉淀的特点，采用醇沉法进行初步分离后，再用强酸性阳离子交换树脂和亲和色谱法进行纯化精制，最后得到的阿卡波糖纯度高达98%。

近几年国内的分离纯化研究也已形成规模，采用了另一种新技术—膜过滤系统［12］，几篇专利中都涉及了此项技术。三达膜科技有限公司［13］将阿卡波糖的发酵液直接用一级膜分离系统，去除菌丝体、可溶性蛋白、培养基及部分色素，得到澄清的阿卡波糖滤液，再用二级膜分离系统进一步浓缩，并脱盐脱色，去除部分单糖、大量的无机盐等小分子杂质，然后再利用层析树脂来纯化可得到高纯度的阿卡波糖，此项技术虽然简单方便，但成本高，不适于工业生产。另外，浙江海正药业股份有限公司［14］采用传统的离子交换树脂分离纯化阿卡波糖，再用膜过滤器除去无机盐、低分子等有机杂质，也可得到高纯度的阿卡波糖，此法已被广泛应用。

王仙菊等［15］通过对阿卡波糖产生菌游动放线菌Actinoplanes sp.AC－5进行研究，对其菌丝片段进行超声波断裂和紫外线诱导处理，得到了高产菌株，通过斜面培养、种子培养、摇瓶发酵得到阿卡波糖发酵液，利用膜分离技术，结合树脂吸附工艺，将阿卡波糖从含有残余盐类、有色物质和其他大分子杂质的发酵液中提纯出来，极大地提高了阿卡波糖的提取收率和纯度，且生产成本低，环境污染少，值得进一步推广应用。

3 阿卡波糖的衍生物研究

利用酶对阿卡波糖的碳侧链两端进行修饰，可得到对碳水化合物水解酶抑制能力更强的阿卡波糖衍生物，目前除了阿卡波糖广泛应用于糖尿病临床治疗以外，阿卡波糖的衍生物也日益引起人们的研究兴趣，研究结果表明［16～20］，通过生物合成－酶学修饰的方法对阿卡波糖进行改造，可以得到更加有效的糖代谢类疾病治疗药物。

Yoon等［16～18］研究发现，利用 Actinoplanes sp.发酵或CGTase、葡聚糖蔗糖酶的转糖基作用将麦芽糖末端连接到阿卡波糖的非还原性末端以得到的阿卡波糖类似物，对水解酶的抑制能力相较阿卡波糖有大幅度的提高;通过CGTase作用于阿卡波糖，将麦芽六糖、麦芽八糖、麦芽十糖结合在Valienamine的C4－OH位置上，得到的阿卡波糖衍生物对α－淀粉酶抑制能力比阿卡波糖高出1～3个数量级;在L.mesenteroides B－512FMC和 B－742CB发酵过程中，利用葡聚糖蔗糖酶将α－D－葡萄糖连接到环己烯链或2－羟基环的还原性末端，通过转糖基反应连接一分子D－葡萄糖以后，得到的acarviosine－葡萄糖对α－葡萄糖苷酶的抑制作用相对于阿卡波糖提高了430倍。

Lee等［19］用纤维二糖和乳糖连接到阿卡波糖的环己烯链或2－羟基环的还原性末端，得到的衍生物对β－葡萄糖苷酶和β－半乳糖苷酶具有抑制作用，而阿卡波糖则对其无抑制作用;另外，将阿卡波糖分子内的麦芽糖用异麦芽糖取代后得到的衍生物对猪胰淀粉酶(PPA)的抑制能力是阿卡波糖的15.2倍。Nam SH 等［20］用 Leuconostoc mesenteroides B－512 FMC发酵得到一种新型的阿卡波糖类似物，利用果聚糖蔗酶将果糖连接在阿卡波糖的末端，形成D－呋喃果糖基，而不是单一的D－葡萄糖。与阿卡波糖相比，阿卡波糖－果糖苷能够同时抑制两个α－葡糖苷酶和两个α－淀粉酶，并且对α－葡糖苷酶和α－淀粉酶的抑制作用分别是阿卡波糖的1.12倍和1.52倍，此外，阿卡波糖－果糖苷还能够同时作用于多种葡聚糖蔗糖酶。

4 不足与展望

阿卡波糖具有良好的降低餐后血糖的作用，在2型糖尿病的治疗中具有可靠的临床疗效，但其市售价格高且存在一定的副反应，一定程度上限制了其普及应用。由于菌株在阿卡波糖的生产过程中会形成一系列的阿卡波糖的同系物影响产率，因此，如果能从基因层面详细阐明其合成机理，将会大幅度提高阿卡波糖的纯度，降低生产成本。此外，从发酵液中分离出活性单体，通过化学修饰和基团改造制备活性更强的阿卡波糖衍生物，以进一步研发出更为安全有效的糖尿病治疗药物将成为阿卡波糖的研究热点。

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