固相萃取柱高效液相色谱法测定复方甘草含片中吗啡的含量

熊水莲，侯 莉

（1.江西制药有限责任公司质量检验部，南昌330052；2.中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，南昌330006）

复方甘草含片是临床上常用的祛痰镇咳复方制剂，主要成分有甘草浸膏、阿片粉、樟脑和八角香油，其中阿片在复方甘草含片中的剂量远小于阿片镇痛、镇静的常用剂量。阿片所含的主要是生物碱吗啡。本文通过建立固相萃取柱高效液相色谱法（HPLC）测定复方甘草含片中吗啡含量的方法，旨在控制复方甘草含片中吗啡的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

北京赛多利斯BT25S电子天平（十万分之一）；日本岛津LC-10AvT紫外检测器；日本岛津LC-10AT VP泵；千谱工作色谱工作站。

1.2 试药

复方甘草含片（江西制药有限责任公司，批号：1201121、1201131、1111251）；吗啡对照品（中国药品生物制品检定所，批号：171201-200521；含量：100%），乙腈为色谱纯，磷酸二氢钾为分析纯，庚烷磺酸钠为分析纯，醋酸为分析纯，氨试液（按药典方法配制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件系统适用性试验

色谱柱为Alltima C8 150mm×4.6mm，流动相为0.002 5mol·L-1庚烷磺酸钠水溶液-0.05mol·L-1磷酸二氢钾-乙腈（5∶5∶2），流速：1.0 mL·min-1，柱温：室温，检测波长220 nm，进样量20 uL。理论板数按吗啡峰计算不低于1 000，吗啡峰与相邻色谱峰的分离度应符合要求。

固相萃取柱系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以供试品溶液的制备中相同的处理条件和洗脱条件试验，精密量取浓度为每1mL中含吗啡对照品0.1 mg的5%醋酸溶液0.5 mL，置处理好的固相萃取柱上，同法洗脱，用5 mL量瓶收集洗脱液至刻度，摇匀，作为系统适用性试验溶液。精密量取系统适用性试验溶液和含量测定项下的对照品溶液各10 uL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按下列公式计算，系统适用性试验溶液结果应在 0.97～1.03 之间[1]。

式中Ax为系统适用性试验溶液吗啡峰面积；Ar为对照品溶液吗啡峰面积；Cx为系统适用性试验溶液浓度；Cr为对照品溶液浓度。

2.2 溶液的制备

1）对照品溶液制备：取吗啡对照品约25 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加含2%甲醇、5%醋酸的溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成对照品贮备液，备用。精密量取2mL对照品贮备液置50mL，加含2%甲醇、5%醋酸的溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2）供试品溶液制备：取复方甘草含片粉末10片称重，精密称定，置磨口锥形瓶中，精密加水90mL，超声处理5min，精密加稀盐酸10mL，摇匀，超声处理20 min使吗啡溶解，取出，放冷，滤过；精密量取续滤液1mL，置固相萃取柱[取固相萃取柱1支，依次用甲醇-水（3∶1）15 mL 与水 5mL 冲洗，再用氨水溶液（pH值为9）冲洗至流出液pH值为9，滴加氨试液适量，使萃取柱内溶液的pH值为9（上柱前另取同体积的续滤液预先调试，以确定滴加氨试液的量），摇匀，待溶剂滴尽后，用水约20mL冲洗，用含2%甲醇、5%醋酸的溶液洗脱，用5 mL量瓶收集洗脱液至刻度，摇匀，即得。

2.3 测定方法

精密量取对照品溶液、供试品溶液各20 uL，照“2.1”项下色谱条件分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算，即得。

2.4 线性关系的考察

取对照品贮备液，置于10 mL量瓶中，用流动相稀释，制得浓度分别为 5﹑10 ﹑15 ﹑20﹑30 μg·mL-1;进样20 uL测定，以对照品浓度对峰面积积分值进行线性回归。结果得回归方程：A=1.42×105C-0.459 5，r=1，显示吗啡在5~30μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

取复方甘草含片的供试品溶液 20μL，按上述色谱条件连续进样5次。测得主峰面积分别为993784、994359、995021、993951、994209，平均值为994265，计算RSD为0.1%。

2.6 重复性试验

取同一批号的复方甘草含片按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下所述色谱条件分别进样重复测定3次，计算平均含量为 0.39 mg·片-1，RSD为0.9%，说明重复性良好，

2.7 稳定性考察

取供试品溶液 1 份，分别于 0﹑2﹑4﹑6﹑8 h 分别进样20μL测定，吗啡峰面积基本不变，RSD为0.9%。

2.8 回收率实验

精密称量复方甘草含片粉末约0.54 g共5份，每份分别准确加入对照品溶液适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项所述色谱条件重复进样3次，计算加样回收率，结果见表1。

2.9 样品含量测定

精密称量各批号复方甘草含片约5.44 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项所述色谱条件分别进样测定，计算其含量，结果见表2。结果表明，该3批复方甘草含片中吗啡的含量均符合规定（0.36~0.44mg·片-1[2]）。

表1 回收率测定结果

表2 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 流动相的选择

本方法中选用庚烷磺酸钠试剂，由于其是离子对试剂，离子对试剂用于高压液相萃取液相色谱中能改善峰形，分析结果重现性好；选用乙腈作为有机相是由于乙腈对柱子的损耗小，洗脱能力比甲醇强,而且不易出现鬼峰。

3.2 波长的选择

由于甲醇的截止峰的波长是190 nm，而乙腈的截止波长是210 nm，所以选择波长为220 nm。

3.3 进样量的选择

本实验采用的仪器是手动进样器进样，由于此仪器的最低定量环进样量为20μL，若使用微量进样器进10μL，易产生气泡且人为因素易产生误差，而采用20μL定量环进样，具有量样精密、快速、便捷等特点。所以本文采用20μL定样环进样。

3.4 色谱柱的选择

C18出峰时间慢，能达到很好的效果；C8出峰时间快，能节约时间，在本实验中测得是吗啡的含量，只要能达到分离的效果即可。故选用C8作为色谱柱。

用固相萃取方法处理复方甘草含片，简便、快速，样品处理时间短。由于样品中吗啡的含量极少，若分离提取和洗涤次数较多，吗啡含量会损失，吗啡在碱性中也容易流失，中国药典[2]中检测的方法流程过于复杂、繁锁，提取的结果误差比较大，而采用本法测定含量更准确可靠，操作起来简捷，可用于复方甘草含片生产的质量控制。

[1]曾勇固.固相萃取技术-HPLC测定复方甘草片中吗啡的含量[J].色谱，1998，16（3）：291.

[2] 中华人民共和国国家药典委员会.中国药典 （二部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：574.