运动对老龄脑缺血再灌注大鼠空间学习记忆能力的影响及其机制

2012-08-09 03:50陈秀恩郑洁皎梁贞文
中国康复理论与实践 2012年1期
关键词:迷宫脑缺血海马

陈秀恩,郑洁皎,梁贞文

脑卒中是临床十分常见的疾病,也是导致人类死亡和病残的主要原因。脑卒中后不仅会出现运动功能障碍,还会出现学习记忆等认知能力降低,严重影响患者的生活质量[1]。研究发现,运动可促进动物海马的神经发生水平,增加突触数量,加快长时程增强(long term potential,LTP)的形成,从而提高动物的学习和记忆能力[2-5]。本研究旨在探索运动对老龄大鼠空间学习记忆能力的影响及脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的调控作用。

1 材料与方法

1.1 单侧脑缺血再灌注动物模型的建立 健康20月龄SD大鼠20只,平均体重(358.53±12.01)g。采用线栓法建立大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MACO)动物模型:10%水合氯醛3ml/kg腹腔麻醉,仰卧绑定,颈前正中切口,分离暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。用微动脉夹夹闭颈总动脉、颈内动脉,结扎颈外动脉,在侧颈总动脉剪一个小口,将直径0.285mm的尼龙线经小口推入,经分叉处进入颈内动脉后撤除微动脉夹,插线经颈内动脉进入大脑中动脉,至遇阻力不能向前推进为止,插入深度为1.8 cm。用丝线固定插线,缝合切口。2 h后拔出尼龙线。模型成功的标志为大鼠即刻出现左侧Horner征。

1.2 动物分组及运动方案 将造模成功的大鼠20只按照体重配对,根据随机数字表将偶数只分配到试验组(n=10),奇数只则分配到对照组(n=10)。由同一研究人员分笼饲养,每笼5只,自由饮食,光照时间7:00~19:00,饲养环境温度22℃,相对湿度45%~55%。

由不同的研究人员将两组每天定时带到跑台。试验组接受规律的运动练习:固定时间段在跑台上运动30min,持续1周;运动强度采取逐渐加大的方式,首先以5m/min运动5min,然后速度增加到8m/min持续5min,最后以11m/min持续20min。对照组则允许其在跑台上自由活动,不限定速度和运动方式。共1周。

1.3 评价指标

1.3.1 Morris水迷宫检测 训练结束后,由不清楚分组情况的研究人员完成检测。水迷宫为一圆形黑色橡胶水池,直径160 cm,水深40 cm,池高50 cm,水温20℃。池壁上等距标设A、B、C、D 4点,分别用白色贴纸作为标记,A点下放一个6×38 cm圆形黑色橡胶平台,平台顶低于水面2 cm。水池中倒入食用黑色色素掩盖平台。水迷宫上方安置摄像机,同步记录大鼠运动轨迹。

前3d,每天固定时间段每只大鼠重复训练3次,依次选择B、C、D点入水,将大鼠面向池壁放入水池,同1次训练所有大鼠入水点相同。记录每个大鼠寻找到平台的时间,即逃避潜伏期(escape latency)。如120 s找不到平台,即将其引上平台,潜伏期记为120 s。大鼠每次爬上平台或被引上平台后,让其在平台上休息10 s。记录3次训练潜伏期的算术平均值作为学习成绩。第4天撤除平台,依次从B、C、D点将大鼠面向池壁放入水中,观测其在120 s内平台周围活动轨迹长占总轨迹长的百分比。

1.3.2 海马内BDNFmRNA检测Morris水迷宫检测后,腹腔注射0.4%戊巴比妥钠1ml/100 g麻醉,开颅取脑,在冰盘上迅速剥离大鼠大脑双侧海马,匀浆。根据Genbank发表的基因序列,设计BDNF和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的引物和探针。上游引物:5'-CCA TAA GGA CGC GGA CTT GT-3';下游引物:5'-GAG GCT CCA AAG GCA CTT GA-3';探针:FAM-CAC TTC CCG GGT GAT GCT CAG CA-TAMRA。

使用经典法RNA抽提试剂盒从海马组织沉淀中抽提总RNA。采用核酸蛋白测定仪(Biophotometer,德国Eppendorf公司)检测260/280吸光度比值,计算RNA浓度。按照cDNA合成试剂盒以2µg RNA为模板合成cDNA,合成的cDNA-20℃储存备用。根据标准曲线计算每个基因的拷贝数。

1.4 统计学分析 应用SPSS 15.0统计软件进行统计分析,所有实验数据以(±s)表示。水迷宫试验数据采用多因素重复测量方差分析,不同组间的差异采用单因素方差分析。不同组间BDNFmRNA含量采用t检验。

2 结果

2.1 Morris水迷宫 两组大鼠Morris水迷宫潜伏期随训练时间增多呈逐渐下降的趋势。在第1天,两组大鼠的潜伏期无显著差异(P>0.05);第2天试验组大鼠的潜伏期低于对照组(P<0.05);第3天两组潜伏期又无显著差异(P>0.05)。试验组大鼠第2、第3天的潜伏期均明显低于第1天(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠潜伏期变化(s)

试验组大鼠平台周围活动轨迹长占总轨迹长的百分比为(9.82±1.09)%,高于对照组(5.98±1.10)%(t=4.25,P<0.05)。

2.2 BDNFmRNA表达 两组大鼠海马缺血侧BDNFmRNA表达量高于非缺血侧(P<0.05)。两组大鼠非缺血侧BDNFmRNA表达量无显著性差异(P>0.05);试验组缺血侧BDNFmRNA表达量明显高于对照组(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠海马组织BDNFmRNA表达

3 讨论

大鼠MACO模型可较好地模拟临床病理过程而常被使用。本研究中使用老龄大鼠MACO再灌注模型,观察适量跑步运动对大鼠空间学习和记忆的影响。

Morris水迷宫主要用于测试实验动物对空间位置感和方向感(空间定位)的学习记忆能力。从信息的加工和提取方式来看,这种空间参考记忆储存的机制主要涉及边缘系统(如海马)以及大脑皮层相关脑区[6-7]。本研究显示,小强度跑台运动可有效提高脑缺血再灌注大鼠的空间学习记忆能力。

运动对学习记忆的影响逐渐成为研究热点。Kramer等研究显示,从不运动的老年人通过步行运动,其思维能力如计划、安排和工作记忆力都相对有所改善[8]。大量动物实验也表明,运动有助于动物海马等与学习记忆密切相关脑区神经元的增殖、存活和分化,促进LTP的诱导,提高实验动物的空间记忆和被动逃避记忆能力[2]。

关于学习记忆的机制,学者们已从神经生理、神经生化和神经解剖等不同的角度进行大量的研究,并形成了很多学说。BDNF是神经营养因子家族成员之一。BDNF在大脑皮层、海马等中枢神经系统部位含量较丰富,对中枢神经系统(central nervous system,CNS)多种类型神经元的生长、发育、分化、维持和损伤修复都具有重要作用,参与了脑缺血性损伤的保护过程[9-10]。

脑缺血后,BDNF及其受体TrkB表达均增加,长期脑缺血将导致缺血中心区神经元坏死,但在梗死灶周围“半暗带”,甚至远离梗死灶的区域仍可见BDNFmRNA显著表达[11-12]。本实验采用实时荧光定量PCR的方法检测海马组织中BDNF表达,所得结果与前人研究一致,即脑缺血再灌注后,缺血侧BDNFmRNA表达都多于非缺血侧。

研究发现,数天的自主性转轮运动能使海马神经元BDNFmRNA和TrkB受体表达明显增强,但并不能引起皮层BDNFmRNA和蛋白表达的变化[13-14]。可见运动对BDNF的影响具有一定的组织区域特异性。但运动对脑缺血再灌注大鼠海马BDNF表达水平的影响未见报道。本研究结果表明,运动能提高脑缺血再灌注大鼠BDNFmRNA的表达。

近年来还发现,BDNF可能参与学习记忆的过程:BDNF可调节突触传递,并参与突触后LTP,其作用类似于神经递质[15]。脑室内注射抗BDNF抗体可使大鼠学习和记忆能力明显下降。提示BDNF可能是运动促进脑缺血再灌注大鼠学习和记忆能力发送的介导因素之一。

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