不同形态氮素对大豆硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性及蛋白质含量的影响

胡润芳，张广庆，滕振勇，林国强

（1.福建省农业科学院作物研究所，福州 350013；2.福建省种子总站，福州 350003）

大豆籽粒蛋白质含量与氮代谢密切相关，许多研究表明硝酸还原酶（Nitrate reductase，NR）和谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）是氮素同化的关键酶[1-2]。已有研究报道追施氮素能提高植物叶片NR和GS活性，并对籽粒蛋白质含量有促进作用；不同氮源对大豆叶片NR和GS活性的影响结论不一；陈煜等认为NO3--N增加大豆叶片NR活性效果最好而增加GS活性效果差，混合态氮和NH4+-N增加大豆叶片GS活性效果好[3-7]。而在蛋白质含量不同的大豆品种中施用不同形态的氮素对这两种酶的活性及籽粒蛋白质含量有何影响少见报道。

本研究选用蛋白质含量差异较大而生育期和产量水平相近、当前在福建省大面积推广种植的3个国审春大豆品种进行氮素试验，旨在进一步探明不同形态的氮素对大豆NR和GS活性及籽粒蛋白质含量的影响，以期为大豆优质育种和科学栽培提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试品种

泉豆7号（蛋白质含量41.83%）、福豆310（蛋白质含量46.04%）、福豆234（蛋白质含量48.93%）。

1.2 试验设计

试验于2010年在福建省农业科学院作物研究所试验地进行。土壤基础肥力：有机质1.00%，全氮0.092%，全磷0.042%，速效磷39.8 mg·kg-1，速效钾192.2 mg·kg-1。选用铵态氮（（NH4）2SO4）、混合态氮（NH4NO3）和硝态氮（KNO3）溶液（氮素浓度均为100 mmol·L-1），在晴天对花荚期植株每穴2株1次性1 L进行灌根处理，以清水为对照，随机区组设计，3次重复，畦长7.4 m，畦宽0.9 m，双行种植。每小区选生长基本一致的5株挂牌标记，诱导48 h，每株各取一片刚完全展开功能叶（倒2、3叶）混合并立即用冰盒带回实验室进行NR和GS活性测定；成熟期收获挂牌5株籽粒，测定籽粒蛋白质含量。

1.3 NR活性的测定

采用活体法[8]。将大豆叶片洗净吸干，用打孔器打成0.5～1 cm的圆片，迅速称取0.5 g样品4份分别置于50 mL三角瓶里，其中1份为对照，3份用于活性测定。对照先加入1 mL 30%的三氯乙酸，然后每瓶中加4 mL 0.1 mol·L-1的磷酸缓冲液（pH 7.5）和 5 mL 0.2 mol·L-1KNO3溶液，将三角瓶反复抽真空，使叶片沉于瓶底。30℃暗培养30 min，取出后立即向活性测试瓶中加入1 mL 30%的三氯乙酸并摇匀，终止酶反应。3 000 r·min-1离心10 min，取上清液2 mL于试管中，加4 mL 1%磺胺和0.2%α-萘胺。摇匀在30℃水浴中保温20 min。然后在520 nm波长下比色测定消光值。

1.4 GS活性的测定

利用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行。将大豆叶片洗净吸干，用打孔器打成0.5～1 cm的圆片，准确称取，按体积比加4倍生理盐水（0.5 g叶片+2 mL生理盐水），制成20%匀浆，3 000 r·min-1离心15 min，取上清液稀释成10%的匀浆进行GS测定[9]。

1.5 蛋白质含量的测定

凯氏定氮法测定[10]。

1.6 数据处理与分析

试验数据采用唐启义的DPS分析软件进行分析[11]。

2 结果与分析

2.1 功能叶片硝酸还原酶（NR）活性的变化

不同形态氮素诱导处理3个大豆品种的NR活性变化见表1。方差分析结果表明：处理间差异极显著（F=5.41**），（NH4）2SO4处理3个大豆品种的功能叶片NR活性最高，并随大豆品种蛋白质含量升高有明显的下降趋势，其次是NH4NO3处理，KNO3处理效果较差，对NR活性几乎没影响。经NH4+-N和混合态氮诱导处理后：泉豆7号功能叶片NR活性分别高于对照水处理101.07%和30.45%，差异极显著（P＜0.01）；福豆310功能叶片NR活性分别高于对照水处理42.40%和12.47%，差异显著（P＜0.05）；而福豆234其功能叶片NR活性分别高于对照水处理11.96%和11.65%，差异不显著。可以看出，NH4+-N和混合态氮诱导处理对蛋白质含量低的大豆品种效果更佳。在3个品种间，对照水处理NR活性福豆234比泉豆7号高46.61%，差异极显著（P＜0.01）；比福豆 310高 13.18%，差异显著（P＜0.05）；福豆310则比泉豆7号高29.54%，差异显著（P＜0.05）。由此可见，高蛋白大豆品种功能叶片中的NR活性高于低蛋白大豆品种。

2.2 功能叶片谷氨酰胺合成酶（GS）活性的变化

不同形态氮素诱导处理3个大豆品种的功能叶片GS活性变化见表2。三种形态的氮素均能明显提高3个大豆品种功能叶片GS活性，处理间差异极显著（F=6.49**），对不同品种诱导效果有差异。泉豆7号功能叶片的GS活性是（NH4）2SO4＞KNO3＞NH4NO3＞水，GS活性分别高于对照水处理99.52%、84.07%、64.49%，与对照比差异极显著（P＜0.01），三种形态氮素间差异不显著；福豆310其功能叶片的GS活性是NH4NO3处理最高，与对照比差异极显著（P＜0.01），（NH4）2SO4和KNO3处理达显著水平（P＜0.05），GS活性分别高于对照水处理40.65%、37.10%、32.51%，三种形态氮素间差异不显著。从表2可以看出，（NH4）2SO4处理GS活性随大豆品种蛋白质含量降低而增强，NH4NO3处理GS活性随大豆品种蛋白质含量升高而增强；高蛋白大豆品种功能叶片中的GS活性也高于低蛋白大豆品种。

表1 不同形态氮素诱导大豆功能叶片的NR活性Table 1 NR activities of functional leaves of soybean genotypes induced with different nitrogens

表2 不同形态氮素诱导大豆功能叶片的GS活性Table 2 GS activities of functional leaves of soybean genotypes induced with different nitrogens

2.3 籽粒蛋白质含量的变化

在三种形态氮素诱导下，3个大豆品种的籽粒蛋白质含量均有不同程度的增加（见表3），品种间差异极显著（F=42.99**），处理间差异显著（F=4.20*）。泉豆7号籽粒蛋白质含量增加最多，分别比对照水处理增加7.23%、6.68%和6.60%，均达到极显著水平；其次是福豆310，（NH4）2SO4和NH4NO3处理，籽粒蛋白质含量分别比对照水处理增加5.64%和6.04%，差异极显著；福豆234籽粒蛋白质含量增加最少，均不显著。以3次重复平均值为基本单位的相关分析表明，NR和GS活性与籽粒蛋白质含量呈显著正相关（r=0.520*和0.550*）。3个大豆品种功能叶片NR活性与其籽粒蛋白质含量相关性有差异，泉豆7号呈显著正相关，福豆310呈极显著正相关，而福豆234呈低度正相关；3个大豆品种功能叶片GS活性与籽粒蛋白质含量均呈极显著正相关；对照水处理的NR和GS活性与对应的籽粒蛋白质含量均呈极显著正相关，相关系数分别为r=0.998**和r=0.861**。

表3 不同形态氮素诱导大豆籽粒的蛋白质含量Table 3 Seed protein content of soybean genotypes induced with different nitrogens

3 讨论与结论

在本研究中，不同形态氮素诱导处理3个大豆品种的籽粒蛋白质含量与功能叶片NR和GS活性呈显著正相关，大豆花荚期高蛋白品种功能叶片中的NR和GS活性均高于低蛋白大豆品种，且对照水处理的NR和GS活性与对应的籽粒蛋白质含量均呈极显著正相关。这与前人的研究有相同之处：李豪喆认为不同品种间叶片中的NR活性有显著差异，其差异与不同品种籽粒蛋白质含量密切相关[12]；张磊等也指出高蛋白品种叶片NR活性高，低蛋白品种叶片NR活性低[5]；陈煜等研究认为，大豆籽粒蛋白质含量与叶片NR活性呈极显著正相关[6]；而GS活性与蛋白质合成也密切相关，GS活性越高越有利于蛋白质合成[8]。因此，可以把大豆花荚期叶片NR和GS的活性作为高蛋白品种选育的参考指标之一。

不同形态的氮素对植物体内的NR活性有不同的影响。赵越等认为NH4+-N抑制甜菜NR的活性[13]；陈煜等认为NO3--N增加大豆叶片NR活性效果最好[6]；王小纯等认为不同小麦品种NR对氮素形态的反应不同，NH4+-N对增加弱筋小麦豫麦50和中筋小麦豫麦49 NR活性较强[14]。而在本研究中NH4+-N增加大豆叶片NR活性效果最好，其次是混合态氮，NO3--N效果较差；是否是KNO3处理中含有的K+再加上土壤中一定量的K+，使K+浓度过高影响到叶片中NR的活性[15]，有待进一步研究，或可能是供试品种NR对NH4+-N反应较敏感。NH4+-N和混合态氮诱导处理尤其对低蛋白大豆品种效果更佳，这可能是因为低蛋白大豆品种叶片NR活性低，对氮素诱导更加敏感。

GS是NH4+进一步形成氨基酸反应过程中的关键酶[16]。研究认为NH4+-N对高等植物及蕨类的GS活性有促进作用[16-17]；张宏纪等认为铵态氮对增加甜菜GS活性效果好于硝态氮[18]。印莉萍等认为NH4+处理的小麦叶部GS活性比NO3-处理的高[19]；陈煜等认为混合态氮和NH4+-N的处理大豆叶片的GS活性比NO3--N处理的高[6]。本研究结果与前人不尽相同，三种形态的氮素均能明显提高3个大豆品种功能叶片GS活性，但对不同品种诱导效果有差异，NH4+-N增加低蛋白大豆品种GS活性效果较好，混合态氮增加高蛋白大豆品种GS活性效果较好；三种形态的氮素对增加低蛋白大豆品种GS活性效果更佳，这也可能是因为低蛋白大豆品种叶片GS活性低，对氮素尤其是对NH4+诱导更加敏感。

经三种形态的氮素诱导处理后，3个大豆品种功能叶片NR和GS活性均有不同程度提高，对籽粒蛋白质含量有促进作用。前人也已研究增施适量氮肥能提高大豆蛋白质含量[20]。在生产上可根据不同大豆品种田间生长情况在花荚期酌情追施适量氮肥以提高功能叶片NR和GS活性从而提高籽粒品质。综合NR和GS活性变化，可考虑优先选用NH4+-N和混合态氮。

氮素诱导处理尤其对提高低蛋白大豆品种的叶片NR和GS活性及籽粒蛋白质含量效果更佳，这是否是因为高蛋白品种功能叶片中NR和GS活性本身处于高值，在生长过程中有利于氮素的吸收和利用，使植株内氮素含量可能已经处于较高水平，氮素对大豆NR和GS活性的促进作用是否具有饱和效应尚有待进一步研究。

[1] 刘丽,甘志军,王宪泽.植物氮代谢硝酸还原酶水平调控机制的研究进展[J].西北植物学报,2004,24(7):1355-1361．

[2] 李常健,林清华,张楚富．高等植物谷氨酰胺合成酶研究进展[J].生物学杂志,2001,18(4):1-3．

[3] 王月福,于振文,李尚霞,等．氮素营养水平对冬小麦代谢关键酶活性变化和籽粒蛋白质含量的影响[J]．作物学报,2002,28(6):743-748．

[4] 柴小清,印莉萍,刘祥林,等．不同浓度的NO3-和NH4+对小麦根谷氨酰胺合成酶及其相关酶的影响[J]．植物学报,1996,38(10):803-808．

[5] 张磊,宋秋来,马春梅,等．大豆叶片硝酸还原酶活性动态研究[J]．东北农业大学学报,2008,39(6):73-76．

[6] 陈煜,朱保葛,张敬,等．不同氮源对大豆硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性及蛋白质含量的影响[J].大豆科学,2004,23(2):143-146．

[7]刘丽,邹德堂．氮素用量对水稻籽粒谷氨酰胺合成酶活性及产量的影响[J]．东北农业大学学报,2009,40(10):1-4．

[8] 张宪政．植物生理学实验技术[M]．沈阳:辽宁科学技术出版社,1994:77-82．

[9] 蔡柏岩,葛菁萍,祖伟．磷素水平对不同大豆品种叶片及籽粒谷氨酰胺合成酶活性的影响[J]．植物营养与肥料学报,2008,14(3):592-596．

[10] 鲁如坤．土壤农业化学分析方法[M]．北京:中国农业科技出版社,2000:308-312．

[11] 唐启义,冯明光．实用统计分析及其DPS数据处理系统[M]．北京:科学出版社,2002．

[12] 李豪喆．大豆叶片硝酸还原酶活力的研究[J]．植物生理学通讯,1986(4):30-32．

[13] 赵越,魏自民,马凤鸣．不同水平铵态氮对甜菜硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活力的影响[J]．中国糖料,2003(1):22-25．

[14] 王小纯,熊淑萍,马新明,等．不同形态氮素对专用型小麦花后氮代谢关键酶活性及籽粒蛋白质含量的影响[J]．生态学报,2005,25(4):802-807.

[15] 焦峰,王鹏,翟瑞常．钾肥对大豆硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性及产量和品质的影响[J].黑龙江八一农垦大学学报,2009,21(4):12-15．

[16] Peter J L,Miflin B J.Glutamate synthase and the synthesis of glutamate in plants[J].Plant Physiology and Biochemistry,2003,41(6-7):555-564.

[17] Marwaha R S,Juliano B O.Aspects of nitrogen metabolism in the rice seedling[J].Plant Physiology,1976,57(6):923-927.

[18] 张宏纪,马凤鸣,李文华,等．不同形态氮素对甜菜谷氨酰胺合成酶活性的影响[J]．黑龙江农业科学,2001(6):7-10．

[19] 印莉萍,刘祥林,柴小清,等．不同浓度不同氮源对小麦离体叶谷氨酰胺合成酶及其相关酶的影响[J]．首都师范大学学报:自然科学版,1997(2):95-99．

[20] 管宇,刘丽君,董守坤,等．施氮对大豆植株氮素和蛋白质含量的影响[J]．东北农业大学学报,2009,40(7):1-4．