观赏植物多倍体诱导研究进展

雷家军,王 冲

（沈阳农业大学园艺学院，沈阳 110866）

1 植物多倍体的特点及其应用

自然界中植物普遍存在多倍体现象，被子植物中约30%～35%是多倍体，其中禾本科植物中70%为多倍体。多倍体是植物最主要的进化方式之一。多倍体育种由于其诱变手段较简单，育出的品种经济价值高，还可有效克服远缘杂交不亲和等特点，因此应用较为广泛。植物多倍体的“巨大性”非常明显[1]。多倍体植株通常花冠大而厚实，花瓣较多，花色变深，茎变粗壮，耐倒伏，叶片变宽厚，适应性增强，光合作用增强。目前，美国、日本等都已通过人工诱导多倍体手段育成一批具有较高观赏价值的花卉品种。到目前为止，许多观赏植物已人工诱导获得了多倍体（见表1），部分已在生产中得到应用。

表1 已诱导获得多倍体的主要观赏植物科、属及种类（1980～2010）Table 1 Family,genus and species of main ornamental plants induced polyploid successfully from 1980 to 2010

2 多倍体的诱导

2.1 诱变材料的选择

离体培养的材料一般是种子、幼苗、生长点、茎尖、愈伤组织、胚状体、悬浮细胞系、小孢子、原生质体或单细胞等，诱变材料选取植株或组织分裂最旺盛的时期和部位。诱变材料在很大程度上决定着诱变的效率。雷家军等采用秋水仙素对草莓种子和茎尖进行离体诱导获得大量加倍株系[45]。李涵等用秋水仙素对二倍体齿瓣石斛试管丛生芽进行诱导获得了四倍体植株[32]。崔广荣等用秋水仙素对蝴蝶兰试管苗离体叶片进行诱变处理获得了四倍体植株[31]。李秀兰等通过秋石斛种子非共生萌发与原球茎诱导，在原球茎发育的原胚期，用混合诱变剂获得了多倍体植株，且未发现嵌合体[33]。

2.2 诱变剂种类选择

2.2.1 秋水仙素

自Blackes lee和Avery等用秋水仙素成功诱导出了四倍体曼陀罗以来，秋水仙素已成为诱导植物多倍体最常用的诱变剂。适宜浓度的秋水仙素能有效阻碍纺缍丝的形成而仍然保持细胞的活性，但胞质不分离而导致染色体数目加倍。在一定浓度范围内，秋水仙素对染色体的结构无破坏作用，处理一定时间的细胞可在药剂去除后恢复正常分裂。秋水仙素只有处理细胞分裂活跃状态的组织才可以使分生组织的染色体加倍。

2.2.2 除草剂

秋水仙素诱导加倍最为广泛，但秋水仙素有剧毒，因此人们一直在尝试使用其他诱变剂。最近发现的甲基氨草磷（APM）、戊炔草胺、安磺灵（Oryzalin）、氟乐灵（Trifluralin）等除草剂在诱导染色体加倍中具有很大的潜力，它们的作用机理和秋水仙素一样[46]。黄权军等采用4种抗微管物质诱导毛新杨2n花粉，结果表明4种诱变剂均可诱导2n花粉，但戊炔草胺的效果最佳[47]。van Tuyl等用安磺灵取代秋水仙素对百合属和尼润属植物进行染色体加倍诱导效果较好，可有效代替秋水仙素[22]。Zlesak等用0.086%氟乐灵对微型月季多倍体诱导效果最佳[39]。Dhooghe等采用三种诱变剂对花毛茛进行离体多倍体诱导，发现2 μmol·L-1氟乐灵处理后多倍体诱变率最高，达27.5%；1 μmol·L-1安磺灵也能得到较高的诱变率；200 μmol·L-1秋水仙素处理后得到23.3%的多倍体植株[38]。由此可知，除草剂与秋水仙素相比，其浓度低、毒性小、效果好，是一种有潜力的染色体加倍诱变剂。

2.2.3 其他辅助剂

在植物多倍体的化学诱导过程中，添加二甲基亚砜（DMSO）、甘油等辅助剂对提高染色体加倍效果有一定作用。二甲基亚砜是较好的渗透剂和增效剂，添加浓度一般为2%～4%。刘亚娟等在秋水仙素诱导新铁炮百合多倍体的过程中，添加2%DMSO能显著提高四倍体的诱导率[48]。Thao等用秋水仙素和安磺灵对处理二倍体海芋根尖时，添加1%DMSO得到了大量四倍体和嵌合体植株[5]。

2.3 诱变处理浓度和处理时间

秋水仙素浓度和处理时间共同影响染色体加倍效果，通常秋水仙素的有效浓度为0.005%～2.0%，一般范围在0.01%～1.0%，而以0.2%～0.4%应用最广泛。对于观赏植物来说，木本类一般多采用较高浓度（如1.0%～1.5%），草本类多采用低浓度（如0.01%～0.2%）。一般来说，浓度越高，处理时间就越短；高浓度、长时间处理对诱变材料伤害严重。处理浓度、处理时间和诱导方法之间是相互关联的。低浓度、长时间的处理多采用固体培养基诱导法，而高浓度、短时间的处理多采用溶液浸渍法。

郑思乡等用不同浓度秋水仙素对三色堇实生苗处理不同时间，以0.1%～0.2%秋水仙素处理12～36 h为佳，诱变率可达到26%，将嵌合体变异株去除顶端优势促发大量的分枝或丛生芽，通过反复分割可分离出稳定的多倍体[44]。张志胜等利用秋水仙素离体诱导红掌愈伤组织表明，在0.05%～0.10%内，低浓度长时间处理时四倍体诱导率高，高浓度短时间处理其诱导率低[7]。李涵等低浓度（0.02%）短时间（24 h）诱导非洲菊两个品种没有得到加倍植株，在0.10%浓度下处理48 h时，诱变率达10%～16%[12]。

2.4 离体培养诱导多倍体的方法

2.4.1 组织培养结合化学诱变

近年来，组织培养技术和化学诱导法相结合的离体培养诱导法已成为一种最常用的染色体加倍方法[49]。利用秋水仙素处理组织培养过程中的丛生芽、原球茎、体细胞胚、种子萌发幼苗等是诱导观赏植物多倍体的有效方法。处理方法是将秋水仙素直接加入培养基中进行培养，或先对植物材料进行秋水仙素处理再放到培养基中进行培养。一般来说，直接处理外植体会产生较大药害。目前，秋水仙素结合组织培养离体诱导加倍，已在百合、大岩桐、马蹄莲、虞美人等多种花卉上取得成功。

2.4.2 胚乳培养

获得三倍体的传统方法是将经秋水仙素诱导的四倍体与二倍体杂交，此法过程较长且烦琐。胚乳是天然的三倍体组织，因此，胚乳培养可获得三倍体植株，如猕猴桃[50]、白桑[51]等。吴清等以红杨桃成熟干种子为材料，萌发后剥离胚乳进行培养，再生植株多数为三倍体，其频率可达73.7%[52]。胚乳培养目前主要应用在果树、蔬菜、水果和粮食作物中，花卉中应用较少，在生产上应用也很少，其难点在于被子植物胚乳离体培养通常很难诱导和分化出苗。此外，胚乳愈伤组织在继代培养中染色体数目不稳定，再生植株多为非整倍体、混倍体。

2.4.3 原生质体融合

原生质体融合是把种内、种间或属间的原生质体融合后再诱导分化成再生植株。体细胞间融合和体-配融合的结果是分别产生四倍体细胞和三倍体细胞，经过进一步培养可形成四倍体和三倍体植株。刘继红等用电场诱导融合丹西红橘和长寿金柑的叶肉原生质体，获得四倍体再生植株[53]。利用细胞融合技术不仅能自体融合单倍体或二倍体花粉，在短期内获得纯合四倍体，还能异体融合野生种与栽培种，产生四倍体杂种，快速实现野生种的优良抗性或品质基因向栽培种转移。此外，细胞融合法还可有效克服植物远缘杂交障碍。

2.4.4 2n配子法

2n配子即未减数配子，它是与体细胞的染色体数目相同的花粉或卵细胞。通过单向多倍化（双亲之一产生2n配子）或双向多倍化（双亲均能产生2n配子）均能提高杂交后代的倍性水平。2n配子法虽然在马铃薯、果树、牧草等作物上早已研究，但在花卉方面国内外报道还很少，目前仅在百合[21]、秋海棠[9]、郁金香[25]、鹤望兰[43]等花卉上获得了2n配子。

2.4.5 其他诱导方法

常用的物理方法有温度激变、电离辐射、机械创伤、渗透压改变、超声波和摘心等，但这些方法诱变率低，因而较少应用。花卉中已在月季、兰花、菊花、大丽花等应用辐射进行诱变育种，发现可在花色、花型、株型上出现有利的变异。

3 多倍体的鉴定

3.1 染色体数目鉴定

根尖染色体数目鉴定是最直接、最有效的倍性鉴定方法。通常采用常规压片法和去壁低渗法进行观察[54]。陈高等考虑到七里香染色体数目较多、不宜计数及压片过程中可能出现染色体断裂、重叠或丢失等，对处理后出现染色体变动的情况做如下处理：二倍体的染色体数目2n=2x=38±2，四倍体的染色体数目2n=4x=76±4，即误差范围控制在10%以内，这样便于更快速确定倍性[55]。

3.2 形态学鉴定

形态学鉴定是最直观、最简单的鉴定法，从幼苗到大苗各期，都可以从形态上观察。通常在秋水仙素早期处理过程中，生长明显受到抑制，生根较晚，且根短而粗壮。经染色体加倍后的多倍体植株，常表现出植株生长缓慢、发育迟缓、物候期晚。崔广荣等诱导的蝴蝶兰多倍体苗在形态上与二倍体差异显著，普通二倍体植株叶片表面平滑，叶片较薄、松散，根相对细长且数量较多；秋水仙素诱导的多倍体试管苗，则叶片紧凑、植株变矮，表现出一定的畸形状态，叶片上下表面粗糙不平，叶片厚实，根粗短且数量相对较少[31]。郑宝强等发现与春石斛二倍体相比，四倍体植株顶芽和侧芽膨大成球状，假鳞茎变粗，下层叶片多呈畸形，叶宽、短而厚，叶色浓绿，叶表面粗糙，叶脆易折断[56]。

3.3 生理指标鉴定

染色体加倍后，一些生理指标如渗透压、呼吸作用、光合速率、蒸腾速率、同工酶及酶谱变化、糖含量、维生素含量、矿物质含量、氨基酸含量等也发生相应变化，可作为间接鉴定植物倍性的依据。郑思乡等发现，三色堇四倍体植株的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度均比二倍体植株高，特别是净光合速率比二倍体高47.8%[44]。王鸿鹤等发现经秋水仙素处理的大岩桐四倍体与二倍体的过氧化物酶酶谱差异明显，还发现多出两条特征性谱带[17]。

3.4 细胞学鉴定

3.4.1 气孔、保卫细胞大小和叶绿体数目

多倍体植株的气孔和保卫细胞变大、保卫细胞的叶绿体数目增多。陈发棣等观察发现多倍体菊花脑的保卫细胞的长与宽均显著大于对照植株，叶绿体数目也远远超过对照植株[13]。阎志红等采用FDA荧光鉴定法发现四倍体西瓜的保卫细胞叶绿体数目增加，每对保卫细胞的叶绿体数由8个增加到15个[57]。

3.4.2 花粉形态及花粉母细胞减数分裂行为

多倍体较二倍体花粉粒萌发孔沟数目增多，花粉粒大小不整齐，败育花粉粒较多，小孢子母细胞增大，在减数分裂中有异常行为。蒋洪恩等发现二倍体临猗梨枣和辣椒枣的花粉粒体积较小，多为3个或2个萌发孔沟；四倍体花粉粒体积显著增大，并出现了一定数量的4孔沟花粉，同时存在大量畸形花粉，花粉活力显著降低[58]。张敩方等发现四倍体金鱼草花粉母细胞减数分裂过程与二倍体对照相比，主要有以下几点不同：染色体配对较复杂；染色体在后期I和后期II的分离过程中落后染色体多；花粉全部败育，花开放时花粉全部粘滞在一起，花药多呈肉质化或发霉烂掉[41]。

3.5 分子水平鉴定

流式细胞计数法可迅速测定细胞核内DNA含量和细胞核大小，是大量试材快速鉴定倍性的有效方法，此方法仅需1 cm2样品就可测定其材料倍性[59]，但其稳定性和准确性还有待提高。Roberts等用此方法测定蔷薇DNA含量来判断加倍植株的倍性水平[40]。此外，原位杂交（GISH、FISH）、RAPD、RFLP等技术也广泛应用到多倍体来源及亲缘关系的鉴定中[60]。

4 多倍体诱导中存在的主要问题

4.1 嵌合体的筛选

在诱导植物多倍体时，出现嵌合体是一种较常见现象。近年来随着组织培养技术与多倍体育种技术相结合，嵌合体的问题正逐步得到解决。李晓艳等对秋水仙素离体诱导越橘多倍体的根尖染色体进行观察，发现变异株系多为二倍体和四倍体的嵌合体[61]。嵌合体的变异细胞往往发生在L-Ⅰ层或L-II层，或呈扇形突变。产生的变异细胞往往生活力弱，分裂速度慢；而正常二倍体细胞生活力强，分裂快，从而淹没变异细胞，表现为回复突变。李涵等对齿瓣石斛的变异植株，采用不定芽技术结合组织培养，通过不断切割多倍体茎、叶等材料，再培养产生新的个体，纯化为完全多倍体，通过该方法已得到了部分相对稳定的植株材料[32]。

4.2 多倍体的低稔性

尽管多倍体具有较多优势，但由正常开花结实的二倍体加倍成四倍体后，其稔性明显降低，结实性很差，种间杂种五倍体加倍成十倍体后则稔性明显提高。目前，多倍体有性生殖的遗传机理仍不十分清楚，人们一直在运用遗传学、胚胎学和分子生物学等手段探明多倍性植株结实率低和种子不饱满的机理。谭素英等以西瓜四倍体和二倍体为试材，从授粉受精和胚胎发育的角度研究认为，花粉萌发率低、胚囊受精率低、胚乳过早解体、大多数胚在发育过程中败育是造成低稔性的原因[62]。很多试验证明，增施磷、钾、镁、硼等肥料可促进同化物质的运转，从而提高稔性。

*本文为特邀专家综述。

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