耐草甘膦大豆种质资源筛选的研究

王 斌，张庆贺，陶 波，栾凤侠,2

（1.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2.黑龙江出入境检验检疫局，哈尔滨 150001）

草甘膦（Glyphosate）是一种广谱灭生性、内吸传导型除草剂[1]，它能与PEP竞争性抑制合酶的活性，形成Epsps合酶-3-磷酸莽草酸（S3P）草甘磷的复合物，从而抑制了合成5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSP合成酶）[2-4]，阻止了莽草酸途径以及芳香族氨基酸的合成，扰乱了生物体正常的氮代谢而使其死亡。

随着分子生物学技术的迅猛发展，已具备了将对草甘膦不敏感的基因转入作物中的能力。1996年，耐草甘膦大豆作为第一个转基因作物以Roundup Ready品牌开始在美国市场投放，并且迅速在世界范围内推广种植[5]。但随着转基因作物的广泛种植，其生态安全性问题也已受到国内外的关注。1999年末，智力果园多花黑麦草（Lolium multiflorum）在草甘膦多年选择的压力下耐性有所提高；Bartsch等经研究发现抗性基因可以通过花粉而漂移[6-8]，随着有关抗性基因的飘移，以及对环境非靶标生物的影响等研究不断深入[9]，转基因技术的不足逐渐显现出来。相比而言，常规育种手段虽然不能像转基因技术一样充分利用物种的基因资源，但是却因为自身没有外源基因的转入而更容易被接受和推广[10]。

非转基因耐除草剂作物的主要培育方法包括除草剂自然选择与杂交法，化学诱变法和植物组织培养法[10]。抗咪唑啉酮类作物是目前通过非转基因技术培育的主要作物，商品化的有玉米、油菜、水稻等[11-13]。陶波等自上世纪90年代开始，利用田间抗性筛选的方法对不同的菜豆品系进行除草剂耐性资源的发掘，在66份菜豆种质资源中成功筛选出了抗草甘膦的菜豆品系89-09、89-05-3[14]。

大豆是我国重要的粮食和油料作物，在我国农业生产以及社会经济生活中都占有相当重要的地位[15]，本研究通过田间筛选结合室内盆栽试验，对国内上百份栽培大豆进行了多年的筛选和鉴定，旨在筛选耐草甘膦作物的品种（系），为耐草甘膦新基因的发掘、耐性作物的理论研究及育种实践提供指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试大豆：褐皮豆等83份大豆品种由黑龙江省农垦科学院提供；DS系列等24份大豆品系由东北农业大学农药教研室提供；东农系列、合丰系列等6份大豆品种由东北农业大学大豆研究所提供。

供试除草剂：农达，41%草甘膦异丙胺盐水剂，美国孟山都公司提供。

喷雾器：山东卫士WS-16手动背负式喷雾器。

1.2 试验设计

田间试验在东北农业大学香坊实验实习基地进行，土壤为黑土。不同大豆品种的播种时间为2009年6月10日，收获时间为2009年10月8日。播种方式为人工单粒点播，试验区行长6 m，行距45 cm，株距10 cm。正常田间管理。植株生长至第一片三出复叶完全展开时进行草甘膦喷洒处理，草甘膦浓度为田间推荐剂量1.24 kg·a.i.·hm-2，每个品种处理株数为200株。施药后第14天观察大豆死亡率，并观察受害症状，描述并制定耐性等级。收获时对耐性品系进行考种分析，主要调查的农艺性状为成熟度、株高、主茎节数、分枝数、单株荚数、单株粒数、单株粒重。

室内生物测定试验在东北农业大学农药学实验温室进行。将大豆种子消毒后，25℃温水中浸泡6 h，27℃催芽12 h，备用。耐性试验采用温室盆栽法进行。播种催芽后的种子，每盆4粒。草甘膦处理浓度梯度为0.38、0.49、0.61、0.74、0.98、1.24、1.55、1.86 kg·a.i.·hm-2，每浓度设置3次重复。计算抑制中浓度，以黑农37的抑制中浓度为标准，求出抑制几率方程，计算耐性倍数。

1.3 数据分析及处理

将死亡率转换成机率值，药剂浓度转换成对数值，计算抑制率回归方程（LD-p曲线），求抑制中浓度（LC50）；以相对耐药性倍数表示耐性程度。所有数据采用Excel和DPS软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 不同大豆品种（系）对草甘膦的耐药性鉴定

表1为对褐皮豆等89份栽培大豆品种进行的田间草甘膦耐性特性的筛选。结果表明，栽培大豆品种对草甘膦耐性很差，但不同的大豆品种对草甘膦的耐性存在差异。在1.24 kg·a.i.·hm-2草甘膦剂量下，褐皮豆等22份品种有一定的耐性。其中褐皮豆和绥无腥豆1号耐性较好，存活率分别为19.5%和15%；另外20份品种耐性较差，存活率从11.5%～2%不等；而剩余67份品种则对草甘膦无耐性，存活率为0。

表2为对DS102号等24个经过筛选的品系进行草甘膦耐性程度检测的田间试验结果。结果表明，东北农业大学提供的DS102等大豆品系对草甘膦的耐性有了显著的提高。在1.24 kg·a.i.·hm-2草甘膦剂量下，DS102和DS204对草甘膦的耐性最强，与对照无明显差异。其余DS系列品种的大豆对草甘膦也具有一定的耐性。

具有优良性状的作物种质是开发作物新品种、进行作物遗传育种改良的重要资源。表1、2的研究结果表明，大豆种质资源中对除草剂的耐性水平存在着极其大的变异范围，不同的大豆品种（系）对草甘膦的耐性明显不同。本研究为DS102等大豆品系耐草甘膦资源的研究提供了材料。

表1 1.24 kg·a.i.·hm-2草甘膦处理下21 d后各常规品种死亡率与耐性等级Table 1 Mortality and patience levels of conventional varieties 21 d after treated with 1.24 kg·a.i.·hm-2glyphosate

表2 1.24 kg·a.i.·hm-2草甘膦处理下21 d后各耐性品系死亡率与耐性等级Table 2 Mortality and patience levels of tolerant lines 21 d after treated with 1.24 kg·a.i.·hm-2glyphosate

2.2 DS耐性大豆品系（种）对草甘膦的耐性水平测定

通过温室盆栽法进一步研究了DS102等5个耐性品系对草甘膦的耐性水平。表3为草甘膦对不同耐性品系的抑制中浓度及耐性倍数。结果表明，随着草甘膦浓度的增大，各个大豆品系的死亡率均呈上升趋势，但耐性品系的死亡率明显低于对照品种黑农37。以黑农37为对照，耐性品系的耐性倍数为4.23～2.48。对草甘膦的耐性程度为DS102 ＞DS204＞DS202＞DS301＞DS405＞黑农 37。其中，DS102号的耐性倍数最高，为4.32，其LC50为1.67 kg·a.i.·hm-2。

表3 不同耐性大豆品系对不同浓度草甘膦处理的耐性水平鉴定Table 3 Tolerance level of different tolerance soybean treated with different concentrations of glyphosate

2.3 草甘膦对大豆生长期株高的影响

采用温室盆栽法进一步研究了草甘膦对耐性品系生长期株高的影响。由表4可知，由于草甘膦的药效发挥较为缓慢，施药后第1天，对照组与施药组的株高差异均不明显；第7天时黑农37品种的对照组和施药组的株高出现了显著性差异（P＜0.05），说明草甘膦在第7天对黑农37显现出较明显的抑制作用，而其余耐性品系虽然也有一定的抑制作用，但与对照相比，差异不显著；在第14天和第21天的时候，各个品系的株高均与对照组产生显著性差异，说明草甘膦在第14到第21天的时候药效发挥最大，且各耐性品系在此时期受到一定的抑制生长的作用；在第30天，DS102和DS204的施药组和对照组的株高无明显差异，并且可以看出各耐性品种的株高均有恢复，说明耐性品种有较好的恢复能力。

2.4 草甘膦对耐性品系农艺形状的影响

收获期对耐性品系的株高、百粒重、单株粒数、有效分枝等性状进行考种研究。考种结果表明，施用草甘膦后，大豆的各性状指标产生了较大的变异范围。

由表5可知，耐性大豆的株高产生了较大的分化，其中DS102和DS202受到的抑制明显轻于DS204、DS301和DS405；DS202的平均株高最高，为85.8 cm。施用草甘膦后，明显增加了大豆品系的有效分枝数。其中，以DS102最为明显，有效分枝数显著高于对照，DS204、DS202、DS301有效分枝数略低于对照，DS405有效分枝数显著低于对照；各品系主茎节数平均值与对照相比变化不大；各品系单株荚数、单株粒数和百粒重等产量指标的变异范围均较大，各指标平均值均低于对照，其中DS204和DS405的单株荚数和单株粒数显著低于对照。

表4 0.98 kg·a.i.·hm-2草甘膦对大豆生长期株高的影响Table 4 Height effect of soybean growth stage treated with 0.98 kg·a.i.·hm-2glyphosate

表5 耐性品系考种数据Table 5 Soybean tolerance test species data

各品系相比来说，DS405的株高和有效分枝的变异范围较大，DS102的单株荚数、单株粒数和百粒重的变异范围较大，其余品种介于两者之间，说明DS405品系内在外形上差异较大，而DS102的品系内在产量上的差异较大。

3 讨 论

转基因植物自80年代初开始研究以来，近10余年植物基因工程研究进展十分迅速[16]，在抗除草剂作物的培育中，鉴定并获得具有天然耐药性的植物是研究的关键，也是进行其他生物技术以及遗传工程修饰的前提。李萍等比较了34个谷子品种对除草剂扑草净（Prometryn）和速收（Flumioxazin）的耐药性差异，明确了除草剂压力下各种生理生化指标的变化[17]。作物不同品种或者是同种作物不同品系之间对除草剂的抗性水平具有很大的差别，是研究者选择天然耐性植株的基础，对于科学使用除草剂和抗除草剂品种的选育有重要的意义。

本研究表明，不同的大豆品系（种）对草甘膦的耐药性存在着显著性差异。DS102、204等品系表现了对草甘膦较高的耐性特性，且受害症状主要为心叶发黄，植株部分叶片萎蔫，但后期逐渐恢复，并且能够正常结实，且通过温室盆栽法进一步验证了耐性品系对草甘膦的耐性水平，得到结果为DS102＞DS204＞DS301＞DS202＞DS405，其耐性倍数均远远高于对照品种黑农37。

普通大豆品种经除草剂处理后多表现为枯萎、不能成活或不结荚。本研究对耐性品系存活植株进行田间农艺性状的考种分析发现，部分植株虽然株高受到了草甘膦的抑制，但是仍能够结荚。且经过对主要的农艺性状的考种分析发现，经过草甘膦处理后耐性植株的有效分支数明显多于对照，这也直接导致了部分耐性植株的单株产量高于对照。其原因可能是草甘膦处理后植株的生长点受到抑制或坏死，导致了耐性植株顶端优势丧失，分枝增多。

4 结论

本研究获得了DS102等耐性大豆品系5份，并通过温室盆栽法对其耐性水平进行了测定，表明其耐性程度远远大于常规栽培品种。田间农艺形状的测定除株高受抑制外，其单株粒数、有效分枝等性状与未施药对照无明显差异。这些耐性品系的获得以及丰富的农艺形状的正向变异为抗草甘膦大豆的育种提供了可能。

[1] 童汉华,曹一平,章善庆.耐草甘膦作物的选育研究概况[J].中国稻米,2006(6):12-14．

[2] Sammons R D,Gruys K J,Anderson K S,et al.Revaluating glyphosate as a transition-state inhibitor of EPSP synthase:Identification of an EPSP synthase EPSP glyphosate ternary complex[J].Biochemistry,1995,34(19):6433-6440.

[3] Saroha K M,Malikv S.Glyphosate-tolerantero Ps:Genes and enzymes[J].Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology,1998(7):65-72.

[4] Tan S,Evans R,Singh B.Herbicidal inhibitors of amino acid biosynthesis and herbicide-tolerant crops[J].Amino Acids,2006,30(2):195-204.

[5] 夏禹．耐草甘膦作物的历史、现状和未来[J]．世界农药,2005,27(5):14-18．

[6] Perez A,Kogan M.Glyphosate-resistant lolium multiflorum in chilean orchards[J].Weed Res,2003,43:12-19.

[7] Bartsch D,Pohl-Orf M.Ecological aspects of transgenic sugar beet:Transfer and expression of herbicide resistance in hybrids with wild beets[J].Euphytica,1996,91(1):55-58.

[8] 苏少泉．草甘膦述评[J]．农药,2005,44(4):145-149．

[9] 张宏军,倪汉文,周志强,等．抗草胺膦转基因作物及其生物安全性研究进展[J]．中国农业大学学报,2002,7(5):54-60．

[10] 陶波,张洪岩,张庆贺,等．非转基因抗除草剂作物研究现状与展望[J]．植物保护学报,2010,37(3):277-282．

[11] Newhouse K,Singh B,Shaner D,et al.Mutations in corn(Zea maysL.)conferring resistance to inidazolinone herbicides[J].Theoretical and Applied Genetics,1991,83:65-70.

[12] Swanson E B,Herrgesell M J,Arnoldo M,et al.Microspore mutagenesis and selection:Canola plants with field tolerance to the imidazolinones[J].Theoretical and Applied Genetics,1989,78(4):525-530.

[13] Webster E P,Masson J A.Acetolactate synthase inhibiting herbicides on inidazolinones-tolerant rice[J].Weed Science,2001,49(5):652-657.

[14] 陶波,秦智伟,曲桂芹,等．菜豆抗草甘膦基因筛选的研究[J]．中国农学通报,1993,9(5):31-33．

[15] 马增林．黑龙江省大豆产业发展问题研究[D]．哈尔滨:东北农业大学,2009:1-2．

[16] 向文胜,肖振平,赵长山．抗除草剂转基因作物[J]．东北农业大学学报,1998,29(2):97-104．

[17] 李萍,杨小环,王宏富,等．不同谷子（Setaria italica（L.）Beauv）品种对除草剂的耐药性[J]．生态学报,2009,29(2):860-868.