器官保存液中腺苷和别嘌呤醇的含量测定

李天媛，邹丽敏，陈建斌，李博，张伟（1.南京医科大学附属南京儿童医院，南京10008；.中国药科大学，南京 10009；.江苏省生产力促进中心，南京 1004）

器官移植为21世纪医学发展的主要方向之一，是治疗终末期器官衰竭唯一有效的根治手段。器官保存是器官移植学的基石，器官保存的根本目的是最大限度减少缺血对离体器官造成的各种损伤，使离体器官保持有效的活力，以便完成运送、配型和手术，使移植器官在手术后迅速恢复功能[1]。器官保存液是器官保存研究中最为重要的问题之一，为了提高患者长期存活率、缓解供器官短缺的矛盾，器官保存液必须能够在一定的时间内最大限度地降低离体器官的缺血性损伤。

再灌注损伤主要是氧自由基大量产生的结果，阻止自由基产生可以防止缺血/再灌注损伤[2]。别嘌呤醇是一种黄嘌呤氧化酶的特异性抑制剂，能竞争性地抑制黄嘌呤氧化酶，减少再灌注期氧自由基的产生。腺苷参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管、增加血流量。因此，别嘌呤醇和腺苷两者均为细胞保存液中的重要成分，是保持离体器官活性的重要物质[3～5]。笔者据此自制了器官保存液，虽然其配比简单，但也可以达到维持细胞周围内环境相对稳定的效果，前期试验表明低温保存状态下可保存16 h。为考察其质量，笔者建立了可同时测定细胞保存液中别嘌呤醇和腺苷含量的高效液相色谱（HPLC）法，并对该方法进行了验证。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-10ATHPLC仪、SPD-10A紫外-可见光检测器（日本岛津公司）；智达N2000色谱工作站（浙江大学）。

1.2 试药

腺苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110879-200202，纯度：99.9%）；别嘌呤醇对照品（江苏方强制药厂，批号：20111023，纯度：99.5%）；样品：器官保存液（南京医科大学附属南京儿童医院，处方：腺苷1.5 g，别嘌呤醇0.15 g，混匀后，加水溶解并稀释至1 000m L，即得）；甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Lichrospher C18（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-50mmol·L－1磷酸二氢钾溶液（20∶80），流速：1.0m L·min－1；检测波长：260 nm；柱温：室温；进样量：20μL。理论板数按腺苷和别嘌呤醇峰计算不低于1 200。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液。精密称取腺苷对照品30mg，置于10m L量瓶中，甲醇溶解并定量稀释至刻度，摇匀，即得腺苷对照品贮备液。精密称取别嘌呤醇对照品约30mg，置于100m L量瓶中，甲醇溶解并定量稀释至刻度，摇匀，即得别嘌呤醇对照品贮备液。分别精密移取2种对照品贮备液各0.5m L，置于10m L量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液。精密移取器官保存液样品1m L，置于10 m L量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀即得。

2.3 专属性试验

取样品溶液5份，分别加入0.2mol·L－1NaOH溶液、1 mol·L－1H2SO4溶液、5%双氧水溶液破坏3 h，在100℃加热1 h和5 000 lx强光照射3 h，在各条件下破坏后测定。结果，腺苷和别嘌呤醇降解产物均能与二者较好地分离，详见图1A～E。另取辅料（即水）进样测定，结果基线平稳，表明其对主成分测定无干扰，证明该条件可以用于腺苷和别嘌呤醇的含量测定，详见图1F。对照品色谱见图1G。

图1 高效液相色谱图A.碱破坏后样品；B.酸破坏后样品；C.氧化破坏后样品；D.热破坏后样品；E.光破坏后样品；F.水；G.对照品；1.腺苷；2.别嘌呤醇Fig 1 HPLC chrom atogram sA.samples treated with alkali；B.samples treated with acid；C.samples treated with oxidation；D.samples treated with heat；E.samples treated with highlight；F.water；G.substance control；1.adenosine；2.allopurinol

2.4 线性关系考察

分别精密量取腺苷和别嘌呤醇对照品贮备液各5.0m L，置于50m L量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。分别精密量取该溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0m L，置于10m L量瓶中，加流动相定量稀释成系列浓度，进样测定。以浓度（c）与峰面积（A）进行回归分析，得腺苷、别嘌呤醇的回归方程分别为：A＝3.116×104c+9.081×103（r＝0.999 9）、A＝2.775×104c－2.425×103（r＝0.999 9），表明二者检测浓度线性范围分别为0.03～0.3、0.003～0.03mg·m L－1。

2.5 定量限和检测限试验

取标准曲线最低浓度点溶液（腺苷、别嘌呤醇浓度分别为0.03、0.003mg·m L－1），用流动相稀释制成一系列浓度的溶液，摇匀，进样测定。经计算得腺苷的定量限和检测限分别为7.5（S/N≥10）、3.7 ng·m L－1（S/N≥3）；别嘌呤醇的定量限和检测限分别为7.6（S/N≥10）、3.8 ng·m L－1（S/N≥3）。

2.6 回收率试验

分别精密取腺苷对照品、别嘌呤醇对照品及水，混匀并制成含腺苷和别嘌呤醇80%、100%、120%处方量的模拟制剂。分别取该模拟制剂按照“2.9”项下方法处理并测定，计算低、中、高浓度回收率。结果腺苷和别嘌呤醇的平均回收率分别为99.14%和99.11%，表明本方法回收率良好，详见表1。

表1 回收率试验结果（n＝3）Tab 1 Resultsof recovery test（n＝3）

2.7 稳定性试验

取样品溶液10m L，室温下避光放置，分别在0、0.5、1、2、4、8、16 h取1m L，经处理后进样测定，结果16 h内腺苷以及别嘌呤醇峰面积没有明显变化，RSD均为0.55%，表明器官保存液含量测定溶液避光放置在16 h内是稳定的。

2.8 精密度试验

2.8.1 进样精密度。取腺苷和别嘌呤醇对照品溶液各重复进样6次，结果RSD分别为0.63%、0.58%，表明进样精密度良好。

2.8.2 重复性。取同1批样品同日内共分析6次，结果腺苷和别嘌呤醇RSD分别为0.46%、0.54%，表明本方法重复性良好。

2.8.3 中间精密度。3位操作者分别在不同时间、采用不同仪器测定同1批样品的含量，计算含量，结果腺苷平均含量为96.2%，RSD＝0.44%；别嘌呤醇平均含量为91.8%，RSD＝0.55%。表明方法中间精密度良好。

2.9 含量测定

精密移取3批器官保存液样品1m L，置于10m L量瓶中，甲醇稀释至刻度，进样测定，外标法计算含量。结果，腺苷含量分别为98.3%、96.2%、98.0%，别嘌呤醇含量分别为96.7%、95.8%、97.2%。

3 讨论

（1）波长的选择。在“2.1”项流动相条件下，腺苷和别嘌呤醇的最大吸收波长分别为280、260 nm。因样品中别嘌呤醇含量较低，故选择260 nm作为检测波长。在该波长处，腺苷和别嘌呤醇都具有较强的吸收，有良好的灵敏度，符合试验的要求。

（2）流动相的选择。参考文献[6]条件并通过试验调整优化，发现甲醇-50mmol·L－1磷酸二氢钾比例为20∶80时，腺苷和别嘌呤醇均能得到较好分离，且降解产物无干扰，最终确定了此流动相。

本文建立的分析方法准确可靠、简便易行，可用于器官保存液中腺苷和别嘌呤醇的含量测定。

[1]朱有华，张 雷.器官保存研究的新进展[J].实用医学进修杂志，2006，34（1）：12.

[2]覃 珍，陈 超.别嘌醇研究的新进展[J].中国药理学通报，2003，19（11）：1 220.

[3]郑军华，闵志廉，李玉莉，等.自制长征-1号多器官保存液的动物实验和部分临床应用研究[J].第二军医大学学报，1999，20（6）：341.

[4]段桂新.器官保存的研究进展[J].医学研究生学报，2006，19（8）：745.

[5]朱水波，殷桂林，孙宗全，等.腺苷预处理保存供心的实验研究[J].临床外科杂志，2003，8（11）：4.

[6]楼丽君，周静安.反相高效液相色谱法测定灵芝及其制剂中腺苷的含量[J].中医药学刊，2006，24（12）：2 332.