基于创新药物研究的心肌缺血/心肌梗死生物模型Δ

王恒，沈祥春，余跃生，杨红宇，吉杨丹（.黔南民族医学高等专科学校，贵州都匀558003；.贵阳医学院，贵阳 550004）

20世纪初期，全球心血管病死亡率仅占总死亡率的10%以下，占发达国家总死亡率的近50%、发展中国家的25%。目前我国每年约有300万人死于心血管病，预计到2020年，因心血管疾病致残的人数将到达2 500万[1]。随着人们的生活方式和饮食结构的变化，心血管疾病患者呈现出年轻化的趋势，这一现状已引起世界各国的高度重视，因此研制有效预防与治疗心血管疾病的创新药物成为当务之急。心血管系统疾患尤以心肌缺血及心肌梗死成为近年来创新药物研究的热点。而创新药物研究的关键是建立基于临床特点的、有效反映药物疗效的生物模型。笔者通过查阅2001－2011年中国知网、万方、维普及PubMed、HighWire Press、EBSCO-ASP等数据库的相关文献，对实验动物的选择和方法进行归纳总结，旨在为心肌缺血/心肌梗死创新药物评价提供合理可靠的生物模型。

1 整体实验动物模型

根据多年来对心肌缺血/心肌梗死实验动物模型的研究，目前传统复制心肌缺血/心肌梗死动物模型所选用的动物大多为哺乳动物，有狗、兔、小牛、豚鼠、大鼠等。由于猪冠状循环系统结构酷似人类，故近年来提倡用家猪或小猪复制心肌缺血/心肌梗死的模型[2，3]。

1.1 冠状动脉结扎法

冠状动脉结扎法是制作心肌缺血模型最早、且至今还普遍使用的方法[4]。其原理为：结扎冠状动脉后血流动力学和心肌代谢的改变与冠心病患者严重心肌缺血及心肌梗死时有相似之处，且梗死发生快、缺血的范围大致固定，可以进行血流动力学监测、心电图J点标测、组织染色检查和血清酶学等综合指标测定。鉴于结扎冠状动脉主干死亡率高，所以目前结扎部位主要选用左旋冠状动脉、冠状动脉前降支；亦有多处结扎的方法，即同时结扎几处的冠状动脉分支，以形成一个梗死区域。经验证明，结扎的冠状动脉因其分布的心肌范围和该区内是否有其他冠状动脉决定着心肌梗死的面积。结扎狗、兔、猫、大鼠等动物的左冠状动脉前降支均可成功造模，因此结扎冠状动脉引起的急性或亚急性梗死疾病模型可用于药物效应研究。结扎狗、家兔、大鼠建模举例如下。

（1）结扎狗冠状动脉左前降支建立急性心肌梗死模型。有文献[5]选用成年健康杂种犬，♀♂不限，体重8.5～13.1 kg。用3%戊巴比妥钠（30mg·kg－1）麻醉实验犬，行气管插管，呼嗳机辅助呼吸，开胸后于犬左冠状动脉前降支的第2对角支分支处以带线缝针进行缝扎。但狗的冠状血管结构与人相比有较大差异，尤其是犬冠状动脉变异多、侧支吻合丰富、室间隔动脉特别发达等，故不利于梗死功能评价。

（2）结扎家兔冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型。有文献[6]选用体重2 kg以上的健康家兔，全身麻醉，仰位固定，除毛；沿胸骨中线切开皮肤、暴露胸骨，沿胸骨左缘剪断1～3根肋软骨；用小开胸器轻轻撑开胸腔切口，可见心包及搏动心脏；提起心包膜正中，用眼科剪将心包膜前部剪开，用止血钳将左心耳轻轻提起，用持针器持小弯针在冠状动脉前降支根部（较深部）穿一线结扎。为减少侧支循环、增大心肌梗死面积，便于观察药物疗效，可在结扎线下约0.5 cm处再穿一线结扎。也可结扎左室支造成心肌梗死，但结扎位置不宜过高。如果进行急性实验，即可进行给药观察；如果进行亚急性实验，结扎后即关闭胸腔，但每天应注射青霉素或链霉素以防止感染[7]。

兔破坏胸膜结扎冠状动脉，方法简便：结扎前降支根部，并进行双重结扎阻断，可减少侧支循环的形成。此法产生的心肌梗死在3 d内较稳定，3 d后有自发缓解的趋势，实验时要注意。

（3）结扎大鼠冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型。有文献[7]选用250～300 g的SD♂大鼠。浅麻醉后，背位固定；用大半个橡皮球（大小正好套住大鼠头颈部）连接到人工呼吸机，胸部去毛、消毒、沿左筋骨中线纵行切开皮肤约2 cm，在第4或第5肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸部挤出心脏；在动脉圆锥与左心耳之间冠状脉处结扎左冠状动脉后，把心脏放回胸腔；迅速缝合胸壁，停止人工呼吸。如果进行急性实验，即可进行给药观察；如果进行亚急性实验，每天应注射青霉素或链霉素以防止感染。

1.2 药物诱导法

（1）药物增加心肌氧消耗。心肌缺氧是由心肌氧的供需平衡失调造成的，心肌需氧增加，供不应求，也是出现心肌缺血甚至坏死的重要原因。拟交感神经药物可使心肌氧消耗增加，大剂量用药会引起动物心肌坏死。引起心肌缺血性损伤常用的药物有异丙肾上腺素、肾上腺素和去甲肾上腺素。从大动物狗到小动物猫、兔、豚鼠、大鼠及小鼠均可用，以应用大鼠为最多。最常使用的药物为异丙肾上腺素，采用大鼠皮下注射50mg·kg－1或将药物加入500m L氯化钠注射液中从家兔耳静脉匀速（4 h）滴入，可分别给药10、20、30mg·kg－1，或直接将药物注入腹腔，均可复制模型[8]。

（2）药物引起冠状血管痉挛。常用药物是垂体后叶素，其使冠状动脉收缩，同时也使外周血管收缩、阻力增加、血压升高，增加后负荷而产生心肌缺血。其可直接作用于不同动物的离体冠状动脉条使之收缩，如使离体兔、猫心的冠状动脉收缩。整体动物（免、豚鼠和大鼠等）静脉注射时，出现典型的缺血性心电图改变，如麻醉狗后静脉注射垂体后叶素，血压急剧升高而血流量明显降低。引起小动物心电图改变的垂体后叶素剂量一般为0.5～1.5 u·kg－1，5～15 s内静脉注入。狗的用量较小，静脉注射0.3 u·kg－1即引起明显的冠状动脉痉挛[9]。由于该方法简单、重复性好、不需特殊设备，因而广泛用于抗心绞痛药物筛选。

1.3 冠状动脉气囊法

通过放置在冠状血管内或血管外的可膨胀气囊（或水囊）阻塞或压迫血管而引起的冠状动脉闭塞[10]。

（1）冠状动脉内气囊法。冠状动脉内气囊法是采用特制的双腔气囊导管，在X射线监视下经狗的颈总动脉插入到左冠状动脉前降支或旋支的合适部位，注入50%的液体使气囊膨胀，每天应注射青霉素和链霉素以防止感染并控制所在部位气囊膨胀的程度。在双腔气囊导管的另一端则分别连接注射器，从外导管注入气体以膨胀气囊和经内导管向缺血区注射药物或抽取血样品，并可测定返回血流和返回压力。如在内导管内装入铂金电极还可测定缺血区冠状动脉内心电图。该法不需开胸，避免了因开胸对血流动力和心肌代谢的影响；可完全或部分闭塞，也可突然或逐渐以及反复闭塞。

（2）冠状动脉外气囊法。冠状动脉外气囊法是在将动物麻醉开胸后，分离出左冠状动脉1 cm左右（大多数是前降支）并放入压迫器内。当气囊膨胀时，压迫血管而阻断血流，短期阻断产生心肌缺血，长期阻断则产生心肌梗死。同一只动物，可在清醒状态下反复阻断冠状动脉以引起心肌缺血。如在压迫器的近心端冠状动脉上放置1个电磁流量计换能器，则可监测闭胸情况下部分闭塞冠状动脉的程度。因此，该法是药理研究中常用的方法之一。

1.4 电刺激法

犬急性心肌梗死模型的建立：肌肉注射氯胺酮100～200 mg麻醉犬、注射用维库溴铵0.1mg松弛犬气管平滑肌，气管插管后连接呼吸机并予心电监护；沿胸骨左缘第3～4肋骨开胸，逐层打开至心包膜，制作心包吊床，清晰暴露左冠状动脉前降支血管；距离前降支开口约1.5 cm处将正、负刺激电极间隔1 min置前降支血管外膜，微电流刺激仪刺激犬冠状动脉血管外膜，电流由小至大逐渐加强，刺激血管外膜15～20 cm，间隔10min。心电监护显示心电稳定后，同部位再次予电流刺激20min至血管外膜颜色加深为止。观察无严重心律失常及出血等，逐层缝合关闭胸腔，置胸腔引流水封瓶[11]。

2 离体心脏模型

近年来，在心肌缺血的研究中，离体心脏灌流技术越来越多被采用。正常离体心肌在缺氧时再给氧可加剧心肌组织缺血性损伤，与临床冠状动脉搭桥术、溶栓术及冠状动脉痉挛等灌注所致心肌损伤相似。

一般用朗根多夫（Langendorff）法对离体猪、兔和大鼠心脏进行灌流，以通Krebs-henseleit液灌流或结扎心脏的冠状动脉，引起全心或局部心肌缺氧，观察整个心脏或局部心肌的冠状动脉血流、心收缩力、心外膜电图以及冠状动脉流出液中乳酸、乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶活性和钾离子、环磷酸腺苷含量以了解心肌缺血程度和心肌缺血时的功能和代谢；并可直接测定心肌内上述指标的改变来评价药物对冠状动脉血管、心脏功能和心肌代谢的直接作用[12]。

在整体条件下心脏的能量来源主要为血液中的脂肪酸，而离体心肌缺氧/再给氧损伤模型能量来源则为灌流液中的葡萄糖，且离体心脏失去整体条件下的神经体液调节，故不可视为此模型完全等同于在体心脏。离体心脏维持不久，故须在一定时间内完成，此亦受到限制。

3 体外培养心肌细胞

3.1 过氧化氢（H2O2）诱导法建立心肌损伤模型

取生长良好的细胞随机分组，同时加入药物4 h后再加H2O2（终浓度为0.5mmol·L－1）刺激细胞4 h，即可造模成功[13]。

3.2 氰化钠复制心肌细胞损伤模型

当氰离子与氧化型细胞色素氧化酶中的三价铁结合后，由于二者的结合力较强，阻止氧化酶中三价铁的还原，即阻断了氧化过程中的电子传递，组织细胞不能利用组织液中的氧（等同于乏氧性缺氧或缺血性缺氧时的组织液中缺氧），细胞处于内窒息状态。因此，氰化钠引起的细胞缺氧模型相当于各种缺氧的终末阶段，即细胞对氧的利用障碍[14]。如，取生长良好的细胞随机分组，给予1μmol·m L－1的氰化钠作用24 h可复制心肌细胞损伤[15]。

3.3 儿茶酚胺诱导心肌损伤模型

儿茶酚胺（Catecholamines，Cas）作为诱导心肌肥大的神经体液刺激因素之一，具有通过肾上腺素受体（Adrenergic receptor，AR）直接促进心肌肥大效应及肌球蛋白基因表达的作用。异丙肾上腺素（ISO）和肾上腺素（NE）是经典的体外诱导心肌细胞肥厚致心肌损伤的因素[16]。如，常规培养心肌细胞2 d后，换液，为了减少血清中的成分对实验结果的影响，换液时更换含小牛血清体积分数为0.000 4的培养基，并采用20μmol·L－1的ISO复制心肌损伤模型[17]。

心肌细胞培养能够排除神经体液、冠状动脉血管差异等因素影响，所有的细胞处于均一的环境中，故实验可靠。但是这个方法是缺氧而不是缺血情况，且缺氧细胞生成的代谢产物在培养基中积累升高，故与整体动物心肌组织缺血时的环境及代谢有所差异。

4 结语

在体心肌梗死模型中结扎冠状动脉是各种模型中最接近冠心病患者严重缺血及梗死的病理状态，其他各种模型亦各有优缺点。所以，在创新药物研究过程中，应根据不同阶段的需要，选择合适的模型，以提高研究效率、降低研究风险。

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