金刚鹦鹉多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

贺青梅，张红见，文 英

（1.青海省天峻县动物疫病控制中心，青海 天峻 817200；2.青海大学农牧学院，青海 西宁 810003）

2009年5月底，青藏高原野生动物园送检病死金刚鹦鹉1只。金刚鹦鹉属大型攀禽，为国家级保护动物。通过询问饲养员了解其临床症状为：发病病程短，发病急，鼻流褐色分泌物，继而突然倒地、抽搐而死亡。剖检观察病理变化：口腔、气管内有较多黏液，整个右侧肺发黑、微肿，肝脏微肿、有点状出血，心冠脂肪有散在出血点，其他脏器病变不明显。笔者对病死金刚鹦鹉病料进行了病原的分离鉴定，分离出1株多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，PM），暂命名为金刚鹦鹉株，报告如下。

1 材料与方法

1.1 病料 无菌采取病死金刚鹦鹉心、肝、脾、肺、肾等脏器，置4℃冰箱待检。

1.2 培养基 鲜血琼脂平板、血清琼脂平板由青海大学农牧学院预防实验室自制；5%犊牛血清肉汤，购自北京燕生政博生物技术有限责任公司，批号：081102；MH培养基，购自北京奥博星生物技术责任有限公司，批号：0081206；各种生化培养基购自北京路桥生物技术有限责任公司，批号：080606。

1.3 实验动物 健康昆明系小鼠4只（16～20g），购于青海省地方病研究所。

1.4 药敏纸片 购自北京天坛药物生物技术开发公司，批号：090311。

1.5 病料制片染色镜检 将病料进行触片，分别革兰、瑞特染色，镜检。

1.6 分离培养 将病料无菌接种于5%犊牛血清营养肉汤、血清琼脂平板、血液琼脂平板，37℃培养18～24h，尔后进行纯化培养。

1.7 生化试验 用灭菌接种环勾取少许纯培养物接种于各种生化培养基中，37℃培养18～24h后观察结果。

1.8 动物试验 将纯培养物制成菌悬液注射小鼠4只，0.2mL／只。另取小鼠2只，腹腔注射0.1mL生理盐水（对照）。

1.9 药敏试验 参照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的操作程序进行。同时用大肠杆菌ATCC 25922作为质控菌株。以NCCLS的标准判断耐药（R）、敏感（S）及中介（I）判定结果。用灭菌生理盐水将纯化好的培养物洗下，稀释后与麦氏比浊管对比后，选取3×108个活菌／mL量的浓度。用灭菌棉拭子蘸取菌液均匀涂布到整个MH培养基上，经温箱干燥3～5min后贴上各种药敏纸片，每块贴3种，37℃倒置培养18～24h后判定结果。

2 结果

2.1 触片染色镜检 革兰染色镜检见革兰阴性、散在的小杆菌；瑞氏染色见到大量两极浓染的蓝色小杆菌。

2.2 菌落形态及培养特性 血清肉汤培养24h轻度浑浊，连续培养4～6d，有菌膜产生，液体清朗，管底有黏稠液体；在鲜血琼脂平板上形成灰白色、圆形、微隆起、半透明、湿润、表面光滑、边缘整齐露珠样的小菌落，不溶血。

2.3 生化试验 将纯培养物接种各种生化培养基，37℃培养24～48h，结果见表1。

表1 金刚鹦鹉株巴氏杆菌生化试验结果

从表1可以看出，金刚鹦鹉株发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、鼠李糖、棉子糖、阿拉伯糖、蕈糖产酸，不分解麦芽糖、木糖、卫矛醇、山梨醇、肌醇；水杨苷阳性；M.R.阳性，V-P阴性；吲哚阳性；明胶液化阳性；鸟氨酸脱羧酶阴性；硫化氢阴性；能利用枸橼酸盐；硝酸盐还原试验阳性；无运动力，氧化酶阴性；尿素酶阴性。

2.4 动物试验 试验组4只小鼠在24h内均死亡，从小鼠体内脏器中分离到与注射菌株一致的革兰阴性小杆菌，对照组小鼠未死亡。

2.5 药敏试验 结果见表2。

3 结语与讨论

3.1 结语 根据实验室分离鉴定，确定为禽多杀性巴氏杆菌。

3.2 讨论 此次发病是由于青藏高原野生动物园2009年4月乔迁新址，此时正处于冬春交替之际，珍禽应激造成机体抵抗力下降，而巴氏杆菌为条件性致病菌，当机体抵抗力下降后，病原菌侵入机体，发生内源性感染。因此，加强预防对于疾病的防控尤其重要。除发病后要迅速隔离，严格消毒，以防病原扩散外，平时应做好饲养管理工作，避免珍禽受寒，减少应激，保持圈舍清洁并作好消毒工作，接种疫苗，以减少本病的发生。

从生化试验看，分离的PM能发酵乳糖、鼠李糖产酸，卫矛醇、H2S阴性，水杨苷阳性，这与有些报道不符。其主要原因是：PM有不同的血清型，不同血清型的生化差异很大，即使是同一血清型不同分离株的生化反应也不尽相同。本次分离到的PM为何种血清型，尚需进一步的鉴定。

根据药敏试验结果可见，此巴氏杆菌对所测试的药物敏感率为88.1%，这与青藏高原野生动物园的珍禽未滥用抗生素，细菌未对大部分抗生素产生耐药性有关。菌株对所测试的喹诺酮类抗菌药、磺胺类抗菌药敏感；对大部分头孢菌素类抗生素、氯霉素、万古霉素、磷霉素和阿奇霉素等敏感；而对大部分青霉素类抗生素、红霉素、克林霉素、利福平等耐药。此结果可为以后的珍禽防治提供参考。

表2 金刚鹦鹉株巴氏杆菌药敏试验结果