青海西宁藏獒巴贝西虫病的血清学调查

马利青，王戈平，衣翠玲，蔡其刚，陆 艳，叶成玉，牛小迎，李晓卉

（青海省畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016）

吉氏巴贝西虫（Babesia gibsoni）是一种蜱媒传播血细胞性原虫，能够导致犬的巴贝西虫病。急性病例最常见的临床症状为发热、贫血、黄疸、食欲不振、饥渴、孱弱、虚脱，通常导致死亡［1］。幼龄犬和老龄犬对B.gibsoni都易感，但是幼龄犬更易感，感染后症状更严重［2］。犬B.gibsoni的诊断主要是基于血涂片的红细胞内的B.gibsoni虫体的检查。然而，由于寄生虫血症水平低，其不适用于检测隐形或慢性感染，有时在红细胞内发现B.gibsoni虫体是非常困难［3］。基于感染红细胞作为抗原的间接荧光抗体检测（IFAT）或者酶联免疫吸附试验（ELISA）在B.gibsoni诊断中也具有一定的特异性［4-5］。因此，利用B.gibsoni特异性抗原建立可靠的、敏感的和特异的检测方法是非常必要的。

寻找用于作为犬B.gibsoni诊断抗原的焦点集中在免疫优势抗原的鉴定，这些抗原能够被来自于地理区域隔离较远、急和慢性感染的犬的血清所识别。最近，Fukumoto等已经鉴定了一个新的基因，该基因编码B.gibsoni的主要免疫抗原P50，并对其在ELISA中的诊断潜力做了评估［6-7］。利用大肠杆菌表达重组全长的P50（P50f）作为抗原的ELISA方法能够显著区分B.gibsoni和B.canis感染犬或未感染的犬［7］。由于重组的P50f几乎完全以不溶性的形式表达，有限的抗原的供应阻碍了本ELISA方法的使用。为了解决这个问题，在本次调查中通过去除高疏水性的信号肽和跨膜区在大肠杆菌中表达了可溶性的P50，并评价了其在ELISA中的诊断潜力。

1 材料与方法

1.1 重组的B.gibsoni GST-P50t 蛋白在以前的研究中进行了克隆、表达和纯化［6］；阴、阳性标准血清，均为日本国家原虫中心玄学南博士惠赠，青海省畜牧兽医科学院兽医所生物技术研究室保存。

1.2 被检血清的采集和处理

1.2.1 118份血清样品均来自西宁地区5个藏獒养殖基地的藏獒，其中：青海雪域獒园50份；青海圣地獒园11份；青海藏獒园12份；青海三哥獒园20份；青海建宁獒园21份。

1.2.2 采血时均空腹、桡静脉采集，采集后摆成斜面，置4℃冰箱5h后，放在室温待血清析出后收集血清，-20℃ 冷冻保存待检。

1.3 其他试剂和耗材 均购自国内和Sigma公司供应商。

1.4 ELISA方法

1.4.1 抗原的包被 重组的B.gibsoni的GSTP50t和GST抗原，按5μg／mL剂量加到包被液中（50mmol／L carbonate-bicarbonate Buffer，pH 值9.6），混匀后加到96孔平底微量板（Nunc，Denmark）的孔里，每孔50μL，并且在4℃条件下培养过夜。

1.4.2 封阻 用含有0.05%Tween-20的PBS冲洗液冲洗1次后，残留的粘附物的部位用含3%脱脂乳的封阻液进行封阻，每孔100μL，并在37℃条件下培养1h。

1.4.3 加样 随后微量板用冲洗液冲洗1次，在封阻液中按1∶100滴度稀释被检血清后，每个样品平行加到微量板的两个孔中，每孔50μL，并在37℃条件下培养1h。

1.4.4 加二抗 用冲洗液冲洗6次后，在封阻液中按1∶4000滴度稀释辣根过氧化物酶结合了山羊抗狗的IgG 抗体（Bethyl Laboratories，USA），稀释后每孔加50μL，并在37℃条件下培养1h。

1.4.5 底物 用冲洗液冲洗6次后，每孔加100 μL底物，每mL底物中含有0.3mg的1，2′-azinobis（3-ethylbenz-thia zoline-6-sulfonic acid），0.1 mol／L柠檬酸，0.2mol／L磷酸缓冲液和0.003%H2O2，每孔加100μL。

1.4.6 读数 用Wellscan MK 3酶标读数仪（Labsystems Dragon，Finland）在光吸收值OD415nm条件下测定光吸收值。

1.4.7 判定标准 ELISA滴度表示成最大稀释度的倒数，且展示ELISA值是等于或大于0.2，在抗原GST-NcSAG1t孔和GST孔之间的光密度吸收值是不同的，两个孔之间的差值为该被检样品的光密度吸收值（OD值）。两孔阳性血清对照孔的平均值必须大于0.2；两孔阴性血清对照孔的平均值必须低于0.2；两孔待检样品的平均值等于或大于0.2为阳性，低于0.2为阴性。

2 结果

2.1 所检测的118份被检血清中，共检出B.gibsoni抗体阳性血清12份，阳性率为10.17%。其中，检青海雪域獒园54份，检出阳性7份，阳性率为12.96%；青海圣地獒园11份，检出阳性2份，阳性率为18.18%；青海藏獒园12份，检出阳性1份，阳性率为8.33%；青海三哥獒园20份，未检出阳性，阳性率为0%；青海建宁獒园21份，检出阳性2份，阳性率为9.52%。结果见表1。

表1 ELISA检测结果 （只、%）

2.2 从本次的检测结果来看，初步说明青海省西宁地区藏獒群中存在B.gibsoni感染。

3 讨论

3.1 B.gibsoni表面抗原P50是用于研究犬巴贝西虫病诊断的一个重要的候选蛋白抗原。为了建立临床上实用的有效的诊断方法，克隆了截头的P50（P50t）基因，该基因缺乏信号肽和C末端疏水区域，并在大肠杆菌中表达带有谷胱甘肽转移酶（GST）标签的融合蛋白。表达的GST-P50t超过90%是以可溶性的形式存在的。相反，GST-P50f（全长）几乎全部以不溶性的形式表达。结果证明，去除疏水性的信号肽和C-末端大大提高了它的亲水性。纯化的GST-P50t用于ELISA检测犬B.gibsoni的抗体。利用GST-P50t的ELISA方法能够明确的区分B.gibsoni感染和未感染的犬的血清［8］。

3.2 ELISA检测其与B.canis canis、B.canis vogeli、B.canis rossi、N.caninum 和L.infantum 间没有交叉反应性［9］。从国内收集的田间血清样本，利用ELISA诊断检查其B.gibsoni感染，犬的血清阳性率为4.8%。从中国收集的所有的家犬的阳性血清样本利用IFAT检测均为阳性［10］。

3.3 随着人们生活水平的日益提高，藏獒在人们的生活中越来越受欢迎，主要作为伴侣动物和身份的象征来饲养，逐渐成为他们日常生活中的一部分。藏獒通过舔舐主人的脸、手等部位，亲密接触后，而将B.gibsoni传染给主人的几率加大。控制蜱媒传播途径，认为是减少该病发病率的一种简单易行的方法。

3.4 建议各藏獒养殖基地应把犬的巴贝西虫病的检疫检测工作纳入到日常工作日程中，切实做好藏獒、养殖人员和业主们的巴贝西虫病的检疫，发现阳性犬应及时按照有关规定进行处理，控制传染源，切断传播途径；对养殖人员或业主检出阳性者，严禁再与养殖基地接触，同时做好他们的治疗工作。

3.5 B.gibsoni在青海经蜱媒传播的具体数据暂时不清楚的，因此有必要进行确定，蜱媒如何传播到该地区牧羊犬的。本次工作对我们今后开展该领域流行病学调查，打下了良好的基础。

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