HPLC 法测定丙戊酸血清浓度的衍生化条件考察Δ

毛桂福（柳州市妇幼保健院药剂科，广西柳州 545001）

丙戊酸钠是临床上常用的抗癫痫药，监测其血药浓度、实现个体化给药，可提高癫痫病的控制率[1，2]和减少不良反应。衍生化-高效液相色谱（HPLC）法[3～7]是目前国内常用的丙戊酸血药浓度测定方法，但很少文献[3]对衍生条件进行考察。为此，本文以α-溴苯乙酮为衍生化试剂，采用单因素法考察丙戊酸的衍生化条件，并建立稳定的衍生化-HPLC法测定丙戊酸血药浓度。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

LC-20AT四元梯度高效液相色谱系统，包括LC-20AT泵、Rheodyne7725i型进样阀、SPD-20A紫外检测器、CTO-20A柱温箱、DGU-20A在线脱气机（日本岛津公司）；Hangping FA1004电子分析天平（上海天平仪器厂）；XW-80涡旋混合器（上海医科大学实验仪器厂）；80-2S台式低速离心机（上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂）；L-128氮吹仪（北京来亨科学仪器公司）。

1.2 试剂

丙戊酸钠对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100963-201101，含量：94.5%）；环己烷羧酸（梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，批号：FAZ02-GJIR，含量＞95.0%）；α-溴苯乙酮（美国A lfa Aesar公司，批号：10148286，含量：98%）；甲醇、乙腈为色谱纯，无水乙醇和乙醚等均为国产分析纯；试验用水为双重蒸馏水。

2 方法和结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Shim-pack CLC-C18（150 mm×4.6 mm，5μm），Shim-pack CLC-C18保护柱（10mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-乙醇-水（66∶10∶24）；流速：1.0m L·min－1；柱温：30℃；紫外检测波长：248 nm；灵敏度：1.00AUFS；进样量：20μL。

2.2 对照品溶液的配制

准确称取57.8mg丙戊酸钠对照品至25m L量瓶中，用0.2mol·L－1氨水溶解并定容，得到浓度为2.01mg·m L－1的丙戊酸贮备液，置冰箱4℃保存，临用时用水稀释成不同浓度的对照溶液。另准确称取环己烷羧酸26.3mg至25m L量瓶中，用0.2mol·L－1氨水溶解并定容至刻度，再取该液1.0m L至10 m L量瓶中，用水定容至刻度即得0.1mg·m L－1的内标溶液。

2.3 血样处理

精密取血清0.1m L，加入内标溶液50μL，再加1mol·L－1硫酸150μL，混匀；加入乙醚2m L涡旋提取1min，离心（3 500 r·min－1）10min，吸取上清液至离心管中；加入20%三乙胺乙腈溶液和4mg·m L－1α-溴苯乙酮乙腈溶液各100μL，涡旋混匀，在55℃水浴反应20～45min；氮气吹干，残渣用甲醇100 μL溶解，旋涡振荡30 s。

2.4 色谱分离情况

在本试验条件下，以5人份的混合空白血清、空白血清加对照品与内标、癫痫患儿服药后的血清加内标，按“2.3”项下方法处理后测定，得到色谱图见图1。

从图1可见，丙戊酸衍生物与内标衍生物分离良好，血清中无明显内源性杂质干扰峰，表明本法有较强的专属性。内标及丙戊酸的衍生物保留时间分别为5.55、8.85min。

2.5 丙戊酸衍生化影响因素的考察

2.5.1 衍生化试剂用量：准确称取α-溴苯乙酮0.526 g，置25m L棕色量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，即得20.0mg·m L－1的衍生剂贮备液。精密移取适量衍生化试剂贮备液置10m L量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度分别为1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、16.0mg·m L－1的衍生化试剂溶液。另配制浓度分别为100.4μg·m L－1和200.7μg·m L－1的丙戊酸钠对照品血清，精密取对照品血清0.1m L，按“2.3”项下方法处理，分别测定在上述7种不同浓度衍生化试剂衍生化反应时丙戊酸衍生物的峰面积，以最大的峰面积为100%产率，计算其他条件下丙戊酸衍生物的产率，结果见图2。

图1 高效液相色谱图A.混合空白血清；B.空白血清+丙戊酸钠对照品+内标；C.患者服药后的血清+内标；1.环己烷羧酸（内标）衍生物；2.丙戊酸衍生物Fig 1 HPLC chromatogram sA.mixed blank serum；B.blank serum+valproic acid control+internql standard；C.serum sample after oral administration+internal standard；1.derivateof cyclohexanecarboxylic acid（IS）；2.derivateof valproic acid

图2 不同衍生化试剂用量对不同浓度血样衍生化反应的影响Fig 2 Effects of different amount of derivative agent on derivatization for different concentration of blood samp le

由图2可见，衍生化试剂用量＞400μg后，中、高浓度血样的衍生物产率都大于95%，波动幅度不大。从衍生化反应程度、测定的重复性及色谱分离等方面综合考虑，α-溴苯乙酮用量选择400～600μg为宜。

2.5.2 三乙胺用量：精密移取不同体积的三乙胺至5个10m L的量瓶中，用乙腈定容至刻度，分别配制成浓度为10%、20%、30%、40%、60%的三乙胺溶液。精密量取200.7μg·m L－1丙戊酸对照品血清0.1m L，按“2.3”项下方法处理（衍生化试剂用量为400μg或600μg），分别测定在上述5种不同浓度的三乙胺溶液作催化剂时丙戊酸衍生物的峰面积，计算丙戊酸衍生物的产率。结果见图3。

由图3可见，当衍生化试剂用量较大（≥600μg）时，三乙胺用量对衍生化反应影响不大；但衍生化试剂用量较小（≤400μg）时，三乙胺用量对衍生化反应影响很大。因此，当α-溴苯乙酮用量为400～600μg时，三乙胺用量以10～20μL为宜。

2.5.3 反应时间与温度：分别精密量取100.4μg·m L－1丙戊酸对照品血清0.1m L，按“2.3”项下方法操作，分别测定在温度45、50、55、60℃条件下反应10、20、30、40、60min时丙戊酸衍生物的峰面积，计算丙戊酸衍生物的产率。结果见图4。

由图4可见，水浴温度＞50℃时，反应10～60min，衍生化比较完全，产率基本无明显变化；但水浴温度为45℃时，反应10min时衍生物产率只有76%左右，需20min才能完全衍生化。考虑到提取溶剂乙醚沸点及操作的方便性，故选择在55℃水浴中反应20～45min。

图3 不同三乙胺用量对衍生反应的影响Fig 3 Effects of different amount of triethylamine on de-

图4 不同温度、时间对衍生反应的影响Fig 4 Effects of different temperature and time on derivatization

2.6 标准曲线的制备

取空白血清0.1m L，精密加入50μL不同浓度的丙戊酸对照品溶液，使其浓度分别为5.0、10.0、20.1、40.1、60.2、100.4、150.5、200.7μg·m L－1，按“2.3”项下方法进行操作，记录色谱。以丙戊酸与内标衍生物峰面积之比（Y）为纵坐标，丙戊酸浓度（X）为横坐标，用加权最小二乘法进行线性回归（W＝1/C），得回归方程：Y＝0.017 2X+0.011 4（r＝0.999 9）。结果表明，丙戊酸血药浓度在5.0～200.7μg·m L－1范围内呈良好线性关系，其最低定量浓度为2μg·m L－1（RSD≤5.6%，n＝6）。

2.7 方法回收率及精密度试验

取空白血清0.1m L，制备低、中、高3种浓度的丙戊酸血清样品，按“2.3”项下方法处理后测定，当日内测定6次，以及1周内测定6次，考察方法的精密度和准确度，结果见表1。

表1 回收率及精密度试验结果（±s ，n＝6）Tab 1 Resultsof recovery and precision test（s±s ，n＝6）

表1 回收率及精密度试验结果（±s ，n＝6）Tab 1 Resultsof recovery and precision test（s±s ，n＝6）

加入量/μg·mL-1 20.1 60.2 150.5日内精密度测得量/μg·mL-1 20.19±0.52 60.08±0.94 150.92±1.96平均回收率/%100.43±2.58 99.80±1.57 100.28±1.30 RSD/%2.57 1.57 1.30日间精密度测得量/μg·mL-1 20.01±0.69 59.67±2.68 149.05±3.72平均回收率/%99.57±3.44 99.14±4.45 99.89±2.50 RSD/%3.34 4.45 2.50

2.8 衍生物的稳定性

制备低、中、高3种浓度的丙戊酸血清样品，按“2.3”项下方法处理后，密封，室温放置。以0 h时测定值为100%，分别放置8、16、30 h时进样测定。结果含量分别为（98.9±3.2）%、（98.8±2.5）%和（99.7±3.6）%，表明丙戊酸衍生物在室温放置30 h是稳定的。

2.9 临床应用

22名服用丙戊酸钠的癫痫患儿，年龄6个月～16岁，服药剂量15～50mg·kg－1·d－1，用本方法监测稳态谷浓度。结果在治疗窗（50～100μg·m L－1）之内10例，低于治疗窗12例。

3 讨论

文献报道的HPLC法[4～7]多采用α-溴苯乙酮作衍生化试剂，其衍生化条件很不一致，如α-溴苯乙酮用量、反应温度和时间分别在100～200μg、45～65℃和10～60min范围内不等。本试验结果表明，衍生化试剂用量为200μg时，对高浓度的丙戊酸血样（200.7μg·m L－1），衍生化程度只有82%左右；在45℃温度下反应10min，衍生物产率只有76%左右。衍生化不完全，易导致测定误差。

本试验发现，丙戊酸与α-溴苯乙酮的衍生反应受到衍生剂用量、三乙胺用量、反应时间和温度等条件的影响，其中衍生化试剂用量影响最大。衍生化试剂用量、三乙胺用量、反应时间和温度可选择的范围分别为400～600μg、10～20μL、45～60℃和20～60min，在这些条件下丙戊酸衍生化程度达到97%以上。在此基础上建立的HPLC法具有线性范围宽、灵敏度高、重复性好等优点，适用于常规血药浓度监测和药动学研究。

在甲醇-水二元流动相中，加入一定量的乙醇，可以缩短丙戊酸衍生物保留时间，提高分析效率。某些国产的乙醚酸性杂质较多，能消耗部分衍生剂而降低衍生物产率，可以用4 mol·L－1氢氧化钠溶液预处理除去酸性杂质。

[1]宋战义，陈庆丽.丙戊酸钠规范化治疗癫痫儿童的临床研究[J].医学理论与实践，2010，23（4）：411.

[2]史昆鹏，李晓晶，李晓丽.丙戊酸钠血药浓度监测对指导儿童癫痫病治疗的临床意义[J].吉林医学，2008，29（23）：2 201.

[3]周莉华，涂 琼，梅步云.HPLC法测定人血清中丙戊酸钠的浓度[J].中国药房，2011，22（26）：2 441.

[4]张志国，雷力力，李 冬，等.HPLC法测定丙戊酸钠血药浓度的衍生化影响因素考察[J].中国药房，2010，21（34）：3 204.

[5]AntunesMV，Nagel V，Linden R，etal.Determination of valproic acid in serum by high performance liquid chromatography with diode array detection（HPLC-DAD），after derivatization with phenacyl bromide[J].Quim Nava，2009，32（5）：1 227.

[6]付翠香，王 军，郑京胜.柱前衍生HPLC法测定丙戊酸钠的血药浓度[J].海峡药学，2008，20（9）：110.