Plackett-Burman试验评价Bacillus subtilis-1101产生物表面活性剂条件

吴志军，王艳红，韩俊芬，姚建波，王彦杰，陈志宝

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

表面活性剂是一类同时具有亲水基团和疏水基团的两性化合物，具有显著降低相界面表面张力的功能[1]。微生物在一定条件下培养也可以分泌表面活性剂，生物表面活性剂主要包括糖脂、脂肽、脂蛋白等。与化学表面活性剂相比，具有产量高、毒性小、成本低、可降解等显著优点[2]，在化工、食品、石油等领域都有广泛的应用[3]。

Plackett-Burman 试验设计是由Plackett 和Burman 于1946年提出的2 水平的部分因子设计方法[4]。可以利用最少的实验次数从众多因素中快速有效地筛选出主要的影响因素，Plackett-Burman 试验设计采用Hadamard 矩阵进行设计，通过N 次实验可以研究N-1 个因素。在试验中每个因素取高低两个水平，高水平取低水平的1.25 倍左右[5]；对实验结果进行分析，可以得到一阶线性模型，通过模型的各项系数比较能分析各因素的显著性水平，筛选出重要因子[6]。由于它具有快速高效等突出优点，Plackett-Burman 试验设计在生物、化工、制药、食品等领域得到了广泛应用[7-9]。

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis-1101 为石油中分离出的产表面活性剂的菌株，以表面活性剂的产量为目标，通过Plackett-Burman 试验设计，利用排油圈法对培养条件进行初步优化。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

菌株：Bacillus subtilis-1101 从石油中分离出的，由实验室保存。

1.2 培养基

1.2.1 LB 种子培养基（g·L-1）

氯化钠10，胰蛋白胨10，酵母提取物5。

1.2.2 发酵培养基

参考毕思宁等人的培养方法[10]，培养基包括以下成分（g·L-1）：NaNO3、（NH4）2SO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、FeSO4·7H2O、CaCO3、液体石蜡。以上成分按试验方案配置后在121 ℃灭菌20 min。

1.3 培养方法

菌株在种子培养基培养8 h 后，将发酵液按照5%接种量置入装有一定量新鲜发酵培养基的250 mL 三角瓶中，在一定pH 值、摇床转速为170 rpm下培养48 h，培养温度为30 ℃。

1.4 表面活性剂测定方法

参考毕思宁等人的排油圈检测法[10]，采用苏丹红Ⅲ染色，将0.5 g 苏丹红Ⅲ溶于100 mL 液体石蜡，搅拌均匀后，过滤除去杂质。取10 mL 苏丹红Ⅲ染色的液体石蜡加入盛有40 mL 蒸馏水的直径9 cm 培养皿中。用微量移液器加入1 mL 发酵液，测量排油圈直径，以排油圈直径大小表示表面活性剂产量的多少。每个处理重复三次。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman 试验设计

对影响表面活性剂产生的NaNO3、（NH4）2SO4、K2HPO4、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCO3、初始pH 值、装液量、液体石蜡等10 个因素为考察变量，每个因素选取高低两个水平，分别编码为+1 和-1，因素编码与水平见表1。按照Plackett-Burman 试验设计方案进行实验，应用Minitab15.0 设计试验方案和数据分析。试验方案与结果见表2。

表1 Plackett-Burman 试验因素水平及编码Table 1 Experimental range and levels of the independent variables used in the Plackett-Burman design

表2 Plackett-Burman 试验方案与结果Table 2 Plackett-Burman design and results

2.2 Plackett-Burman 试验结果分析

利用minitab15.0 对Plackett-Burman 试验结果进行回归分析，得到排油圈直径与各因素之间的回归方程Y=5.696+0.13A-0.014B+0.15C+0.31D-0.13E+0.14F-0.096G-0.054H-0.184I-0.296J，各因子对响应值的效应可从方差分析表3 看出，在10 个因素中，KCl、装液量、液体石蜡的量三个因素对响应值的影响达到显著水平，其中，因素KCl 对响应值的为正效应，装液量、液体石蜡则为负效应。其他因素则对目标值则没有显著影响。这点也可以从图1 中的标准化效应的Pareto 图看出。方差分析结果表明，模型决定系数R2为0.999 5，较好的描述了表面活性剂的产生过程。

表3 模型方差分析结果Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for the first order model determined from the Plackett-Burman design

图1 标准化效应的Pareto 图Fig.1 Pareto chart of standardized effects

3 结论

采用12 次Plackett-Burman 试验设计方法对影响枯草芽孢杆菌-1101 表面活性剂产生的培养条件进行了初步筛选，结果表明，在10 个因素中，KCl 的量、装液量、液体石蜡三个因素对表面活性剂的产生有显著影响。其他因素不显著。此结果为下一步的优化实验提供了一定的依据。

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