RP-HPLC 法测定卡铂制剂中卡铂的含量

张 萍，杨 慧，宋 梅，曹 丹（江苏省徐州医药高等职业学校，江苏徐州 221116）

卡铂（Carboplatin，CBP）化学名为顺-二氨-1，1-环丁烷二羧酸合铂，属第2代铂类广谱抗癌药[1]，其抗瘤谱、疗效和骨髓毒性均与顺铂相似，而胃肠道和肾毒较顺铂轻，临床广泛用于多种恶性肿瘤的治疗。2000年版[2]、2005年版[3]、2010年版[4]《中国药典》中以高效液相色谱（HPLC）法作为药物卡铂的含量测定方法，在该方法中均以水为流动相，这一点值得商榷。因为当小孔径、端基封口良好的反相填料色谱柱使用接近100%的水为流动相时，有时会发生疏水坍塌现象，此现象是由流动相不浸润固定相表面所致。同时，卡铂的极性较强，极易与色谱柱未键合的硅羟基键合，从而导致峰的对称性达不到药典的要求，实际操作中其对称性大大偏离药典的规定，见图1。为此，笔者对卡铂含量的测定条件进行了研究，解决了上述问题。

1 仪器与试药

Agilent 1200型HPLC仪，包括四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器（美国安捷伦公司）；CP 6201型万分之一电子分析天平（德国赛多利斯公司）。

卡铂对照品（中国食品药品检定研究院，批号：10322-0101，纯度：99.99%）；卡铂注射液（齐鲁制药有限公司，批号：9110102ES、9080082ES、9110204ES，规格：10 mL：100 mg/支）；注射用卡铂（齐鲁制药有限公司，批号：9060081DA、9060082DA、9060083DA，规格：0.1g/支）；甲醇为色谱纯（美国Merk公司，规格：4 L）；辛基磺酸钠为色谱级试剂（Regal-Biotechnology Company、25 g）；水为超纯水（石英亚沸蒸馏并用美国Millipore公司Milli-Q 50型超纯水仪处理）；其他试剂均为分析纯。

图1 高效液相色谱图A.以往色谱条件下卡铂峰；B.新色谱条件下的卡铂峰Fig 1 HPLC chromatogramsA.chromatographic peak in previous method；B.chromatographic peak in new method

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：SHIMADZU RP-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（含2.5 mmol·L－1辛基磺酸钠，V/V＝10∶90）；流速：1.0 mL·min－1；进样量：10 μL；柱温：40 ℃；检测波长：229 nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取卡铂对照品10.1 mg，置于10 mL容量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液备用。

2.2.2 注射用卡铂溶液的制备 取注射用卡铂样品（批号：9060081DA）约10 mg，精密称定，置于100 mL容量瓶中，加入超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。进样前取适量过0.45 μm微孔滤膜。

2.2.3 卡铂注射液的制备 精密吸取卡铂注射液样品（批号：9110102ES）1 mL，置于100 mL容量瓶中，加入超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。进样前，取适量过0.45 μm微孔滤膜。

2.2.4 阴性供试品溶液的制备 根据注射用卡铂处方，取5.0 mg甘露醇置于100 mL容量瓶中，加超纯水至刻度，即得注射用卡铂阴性样品溶液；根据卡铂注射液处方取适量乙二胺四乙酸，注射用水溶解，稀释即得卡铂注射液阴性样品溶液。

取标准品和供试品溶液进样，结果卡铂对照品中卡铂的理论板数为7 384，对称因子为0.96；注射用卡铂及卡铂注射液样品中卡铂的色谱峰与相邻组分的色谱峰的分离度均＞1.5，理论板数分别为8 300、8 183，对称因子分别为0.98、0.98。色谱见图2。

图2 高效液相色谱图A.卡铂对照品溶液；B.注射用卡铂样品溶液；C.卡铂注射液溶液；D.注射用卡铂阴性样品溶液；E.卡铂注射液阴性样品溶液；1.卡铂Fig 2 HPLC chromatogramsA.carboplatin solution control；B.Carboplatin for injection solution；C.Carboplatin injection solution；D.negative sample of Carboplatin for injection；E.negative sample of Carboplatin injection；1.carboplatin

2.3 线性关系考察

精密吸取已制备的1.01 mg·mL－1的卡铂对照品贮备液适量，将其稀释成浓度分别为0.505 0、0.252 5、0.101 0、0.050 5、0.025 25、0.010 1 mg·mL－1的卡铂对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件，分别进样10 μL，每种浓度分别重复进样3次，记录峰面积，以各对照品的检测浓度（C，μg·mL－1）为横坐标，峰面积积分值（A）为纵坐标，进行线性回归，得卡铂回归方程A＝7.018 1C+8.1957。结果表明，卡铂检测浓度在10.1～505.0 μg·mL－1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系（r＝0.999 9）。

2.4 精密度试验

取“2.2.1”项下浓度为0.101 mg·mL－1的卡铂对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积积分值。结果，卡铂的峰面积RSD＝0.81%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

精密吸取“2.2.2”和“2.2.3”项下的供试品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件每隔6 h进样一次，共进样9次，记录峰面积积分值。结果，注射用卡铂及卡铂注射液样品中卡铂峰面积的RSD分别为0.89%、0.83%，表明样品在48 h内稳定。

2.6 重复性试验

分别精密取同一批号注射用卡铂（批号：9060081DA）及卡铂注射液（批号：9110102ES）样品适量，各6份。按“2.2.2”和“2.2.3”项下供试品溶液制备方法制备，进样10 μL，记录峰面积和对称因子。结果，注射用卡铂及卡铂注射液样品中卡铂峰面积的RSD分别为0.73%、0.80%，卡铂对称因子的RSD分别为0.96%、1.00%，表明重复性良好。

2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的注射用卡铂及卡铂注射液供试品溶液适量，各9份，分别加入相当于样品中卡铂含量80%、100%、120%的对照品（各3个），按供试品溶液制备和测定方法操作，以回归方程计算供试品中卡铂的平均回收率，结果见表1、表2。

表1 注射用卡铂的加样回收率试验结果Tab 1 Results of recovery tests of Carboplatin for injection

表2 卡铂注射液的加样回收率试验结果Tab 2 Results of recovery tests of Carboplatin injection

2.8 样品含量测定

分别取3批注射用卡铂和卡铂注射液药品，按照“2.2.2”和“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积，计算含量，结果见表3。

表3 注射用卡铂和卡铂注射液含量测定结果（n＝5）Tab 3 Results of content determination of Carboplatin for injection and Carboplatin injection（n＝5）

3 讨论

3.1 方法的创新性

按照2000年版[2]、2005年版[3]、2010年[4]版《中国药典》中卡铂的色谱条件，卡铂峰的对称性达不到药典的要求；本文所提出的色谱条件能很好地解决这一问题，并通过有机相的加入，延长了色谱柱的使用时间。

3.2 溶剂的选择

由于卡铂溶剂水溶性好而脂溶性差，故本试验以水为溶剂，分离效果较好。

3.3 流动相的选择

卡铂药品成分单一，杂质含量较少，在反相色谱条件下，出峰时间短，故等梯度洗脱应该可以满足需要。在水相流动相中加入离子对试剂辛基磺酸钠可以较好的改善峰形，以满足药典对峰对称性的要求。在满足对称性和理论板数的同时适当加入少量甲醇改善纯水的流动相环境，从而更有利于色谱柱的保养。

3.4 检测波长的选择

很多文献报道用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定卡铂药物制剂中卡铂的含量[5～11]，但对于流动相的选择和对称性的问题并没有过多关注。本研究所用HPLC仪配有二极管阵列检测器，通过对卡铂标准品进行全紫外波长的扫描，确定了229 nm为检测波长，这也与报道一致[6]。本文采用RP-HPLC法在229 nm波长处测定了卡铂药品中卡铂的含量，结果表明该方法迅速、可靠、重复性好，能同时满足含量测定中对流动相、对称性和理论板数的要求，经实验室验证，具有较好的实用性且易于推广应用，适用于卡铂制剂中卡铂含量的测定。

[1]刘 放，黄卫平.卡铂及其制剂的含量测定和稳定性实验[J].中国医院药学杂志，1997，17（9）：403.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].2000年版.北京：化学工业出版社，2000：136-137.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：108-109.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：134.

[5]李 杰，王景萍，周丽莉，等.卡铂血药浓度高效液相色谱分析[J].医院论坛杂志，2004，20（25）：23.

[6]李 杰，王景萍，周丽莉，等.高效液相色谱法同时测定人血清中卡铂、假尿苷含量[J].中国药学杂志，2005，40（9）：691.

[7]朱自强，王斐珍.卡铂及其制剂含量测定方法的探讨[J].浙江省医学科学院学报，1996，7（3）：32.

[8]蔡 梅，徐薇薇.高效液相色谱法测定注射用卡铂和奈达铂的含量[J].海峡药学，2007，1（19）：22.

[9]杜春双，陈 琛，宋晓坤，等.卡铂注射液的含量测定及其临床使用稳定性研究[J].中国药房，2011，22（5）：442.

[10]周立霞，哈敏文.贝伐单抗联合培美曲赛加卡铂二线治疗晚期非小细胞肺癌的临床观察[J].中国药房，2011，22（6）：529.

[11]陈百松，朱小勇，郭银红.紫杉醇联合卡铂二线治疗进展期胃癌的疗效观察[J].中国药房，2010，21（40）：3 797.