人喉鳞癌Hep-2细胞血红素加氧酶1表达及其对卡铂作用的影响

吕欣，宋冬梅，王宝山，2(河北医科大学第一医院，石家庄05003;2河北医科大学)

人喉鳞癌Hep-2细胞血红素加氧酶1表达及其对卡铂作用的影响

吕欣1，宋冬梅1，王宝山1，2
(1河北医科大学第一医院，石家庄050031;2河北医科大学)

摘要:目的探讨人喉鳞癌Hep-2细胞血红素加氧酶1(HO-1)表达对卡铂作用的影响及其可能的作用机制。方法将对数生长期Hep-2细胞分为六组。空白对照组不干预，ZnPP(HO-1抑制剂锌原卟啉)组加入ZnPP 10 μmol/L; Hemin(HO-1诱导剂氯化血红素)组加入Hemin 10 μmol/L;卡铂组加入卡铂10 μg/mL; Hemin联合卡铂组先加入Hemin 10 μmol/L，作用1 h后再加入卡铂10 μg/mL; ZnPP联合卡铂组先加入ZnPP 10 μmol/L，作用1 h后再加入卡铂10 μg/mL。每组设5个复孔，加药后培养24 h。采用MTT法观察各组细胞存活率; RT-PCR、Western blotting法检测各组细胞内HO-1mRNA和蛋白表达情况;dCFH-DA探针检测各组细胞内活性氧(ROS);流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果①细胞存活率:与空白对照组比较，卡铂组和ZnPP组明显降低，Hemin组明显升高(P均＜0.05);与卡铂组比较，ZnPP联合卡铂组明显降低，Hemin联合卡铂组明显升高(P均＜0.05)。②细胞HO-1mRNA和蛋白相对表达量:与空白对照组比较，卡铂组和Hemin组明显升高，ZnPP组明显下降(P均＜0.05);与卡铂组比较，ZnPP联合卡铂组明显降低，Hemin联合卡铂组明显升高(P均＜0.05)。③细胞凋亡率:与空白对照组比较，卡铂组、ZnPP组明显升高(P均＜0.05);与卡铂组比较，ZnPP联合卡铂组明显升高，Hemin联合卡铂组明显降低(P均＜0.05);④细胞内ROS活性:与空白对照组比较，卡铂组、ZnPP组显著增高(P均＜0.05);与卡铂组比较，ZnPP联合卡铂组明显升高，Hemin联合卡铂组明显降低(P均＜0.05)。结论HO-1在Hep-2细胞内的高表达可影响卡铂对Hep-2细胞的促凋亡作用，应用ZnPP后HO-1表达下调，同时提高了人喉鳞癌Hep-2细胞在卡铂作用下的凋亡率，这一过程可能与增强细胞内ROS水平相关。

关键词:喉鳞癌;血红素加氧酶1; Hep-2细胞;卡铂;细胞凋亡

HO-1 expression in human laryngeal squamous-cell carcinoma Hep-2 cells and its influence on Carboplatin’s effects

LYU Xin1，SONGdong-mei，WANG Bao-shan
(1 The First Hospital of Hebeimedical University，Shijiazhuang 050031，China)

Abstract:Objective To investigate the influence of heme oxygenase-1(HO-1)expression in human laryngeal squamous-cell carcinoma Hep-2 cells on the Carboplatin’s effects and its possiblemechanism.Methods Hep-2 cells in the logarithmic phase weredivided into six groups.The blank control group was not treated，ZnPP group was treated with 10 μmol/L HO-1 inhibitor，Hemin group was treated with 10 μmol/L HO-1 inducer，and Carboplatin group was treated with 10 μg/mL，Hemin combined with Carboplatin group was treated with 10 μmol/L Hemin alone for 1 h and then 10 μg/mL Carboplatin，ZnPP combined with Carboplatin group was treated with 10 μmol/L ZnPP alone for 1 h and then 10 μg/mL Carboplatin.These six groups all had five complex holes and were cultured for 24 h afterdosing.The survival rates were evaluated bymTT assay.The expression of HO-1mRNA and protein wasdetected by RT-PCR and Western blotting.Intracellular ROS activity was examined bydCFH-DA probe.The apoptosis rate was performed by flow cytometry.Results①the cell survival rate: compared with the control group，the survival rates of Hep-2 cells in the ZnPP and Carboplatin groups were significantlydecreased，but the survival rate in the Hemin group was increased(all P＜0.05); compared with the Carboplatin group，the survival rate of the Znpp combined with Carboplatin group wasdecreased and the He-

min combined with Carboplatin group was increased(all P＜0.05).②HO-1 inmRNA and protein levels: compared with the control group，the expression of HO-1mRNA and protein was increased in the Hemin and Carboplatin groups and wasdecreased in the ZnPP group(all P＜0.05); compared with the Carboplatin group，the Znpp combined with Carboplatindecreased，but HO-1 expression was increased in the Hemin combined with Carboplatin group(all P＜0.05).③the apoptosis rate: compared with the control group，the apoptosis rates in the Carboplatin and ZnPP groups were increased(all P ＜0.05); compared with the Carboplatin group，Znpp combined with Carboplatin increased the apoptosis rate，but Hemin combined with Carboplatindecreased the apoptosis rate(all P＜0.05).④the ROS activity: compared with the control group，the the ROS activities in the Carboplatin and ZnPP groups were increased(all P＜0.05); compared with the Carboplatin group，Znpp combined with Carboplatin increased the ROS activity，but Hemin combined with Carboplatindecreased the ROS activity(all P＜0.05).Conclusions HO-1 overexpressionmay affect the pro-apoptotic effects of Carboplatin on Hep-2 cells，and the application of ZnPPdown-regulates the HO-1 expression and increases the apoptosis rate of Hep-2 cells with treatment of Carboplatin.In this process，the elevation of intracellular ROS activitymay be involved.

Key words:laryngeal squamous-cell carcinoma; heme oxygenase-1; Hep-2 cells; Carboplatin; apoptosis

血红素氧合酶1(HO-1)属于微粒体催化酶类，是降解血红素重要的限速酶之一，其可将血红素分解为一氧化碳、Fe2 +、胆绿素等［1～3］。HO-1是一种细胞保护性酶，具有抗炎、抗氧化及抑制细胞凋亡等重要生物学作用;但近年来研究发现，HO-1的这一细胞保护作用及抗凋亡特性可能是促进肿瘤细胞生长、转移及产生治疗抵抗的重要因素［4～6］，但具体机制不清。目前，HO-1在头颈部肿瘤尤其是喉鳞癌中的作用鲜见报道。2014年11月～2015年5月，我们观察了HO-1诱导剂氯化高铁血红素(Hemin)和HO-1抑制剂锌原卟啉(ZnPP)对人喉鳞癌Hep-2细胞内HO-1表达的影响及HO-1表达对卡铂作用的影响，分析HO-1与喉鳞癌化疗抵抗的关系，为喉鳞癌的治疗寻找新的靶点。

1　材料与方法

1.1材料人喉鳞癌Hep-2细胞株(以下称Hep-2细胞)本实验室冻存。DMEM/F12购自Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青公司; Hemin购自美国Sigma公司(Lot NO.51280); ZnPP购自美国Santa Cruz Biotechnology公司(SC-200329);卡铂购自山东齐鲁制药有限公司(国药准字号H10920028);二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司(Lot NO.D-5879);四甲基噻唑基四唑(MTT)购自美国Sigma公司(Lot NO.M2128);碘化丙啶(PI)购自美国Sigma公司(Lot NO.P4170); HO-1及内参GAPDH引物由上海生工合成;兔抗人HO-1单克隆抗体购自美国abcam公司(ab13243);内参β-actin购自北京博奥森试剂公司(bs-0061R);活性氧检测试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所(S0033); RT-PCR检测试剂盒购自立陶宛Fermentas公司(K1611，K1081)。

1.2细胞培养、分组及干预将Hep-2细胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM/F12培养液中，于37℃、5% CO2的孵箱内培养。以0.25%胰酶消化传代，2～3d传代1次，实验细胞均处于对数生长期。将Hep-2细胞胰酶消化后，以每孔5×103个细胞接种于96孔板，待细胞贴壁12 h后分为六组。空白对照组不干预，ZnPP组加入ZnPP 10 μmol/L; Hemin组加入Hemin 10 μmol/L;卡铂组加入卡铂10 μg/mL; Hemin联合卡铂组先加入Hemin 10 μmol/L，作用1 h后再加入卡铂10 μg/mL; ZnPP联合卡铂组先加入ZnPP 10 μmol/L，作用1 h后再加入卡铂10 μg/mL。每组设5个复孔，加药后均培养24 h。

1.3 Hep-2细胞存活率检测采用MTT法。每孔加入5mg/mLmTT 20 μL，继续培养4 h后，彻底去上清后加DMSO 200 μL/孔，振荡30min至结晶完全溶解，酶标仪测定570 nm处的光密度值(OD 值)，实验重复5次。细胞存活率(%)=(OD试验孔/OD对照孔)×100%。

1.4 Hep-2细胞HO-1mRNA及HO-1蛋白表达检测采用RT-PCR法检测各组Hep-2细胞HO-1mRNA表达:各组加药培养24 h后TRIzol法提取总RNA，取等量RNA(500 ng)逆转录为cDNA。HO-1上游引物5'-CTTTGGTCAATGACACCGTG-3'，下游引物5'-TGTTTGTGGTAAGCCATCCA-3'，产物长度168 bp;β-actin上游引物5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'，下游引物5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3'，产物长度540 bp。基因扩增反应条件: 95℃预变性5min; 95℃、30 s，57℃、30 s，72℃、30 s，β-actin 26个循环，HO-1 29个循环，72℃延伸10min，4℃、2 h。产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳，利用Lab Work5.0系统进行图像分析。采用Western blotting法检测HO-1蛋白表达:各组加药24 h后收集细胞，加入4℃预冷的RIPA细胞裂解液300

μL冰上裂解30min，期间细胞刮刀刮3次，4℃、12 000 r/min离心20min，取上清液5 μL，BCA法蛋白定量，取总蛋白量一致后进行SDS-PAGE电泳，电转至PVDF膜上，然后置于5%脱脂奶粉TBST溶液封闭2 h，加入1∶2 000兔抗人HO-1一抗，同时用兔抗人β-actin(1∶500)作为内参，4℃过夜。辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(1∶5 000)室温孵育2 h后，TBST溶液洗涤15min/2次，ECL发光显色，结果扫描，HO-1蛋白条带灰度值测定。

1.5Hep-2细胞内活性氧(ROS)检测采用DCFH-DA探针检测。加药培养24 h后，胰酶消化、终止、收集细胞，收集细胞后装载探针，按照1∶1 000用无血清培养基稀释DCFH-DA，使终浓度为10 μmol/L，细胞收集后悬浮于稀释好的DCFHDA中，细胞密度为1×106/mL，37℃细胞培养箱内孵育20min，无血清培养基洗3次，488 nm激发波长，525 nm发射波长，检测各组荧光强度，结果以平均荧光强度表示细胞内ROS的相对活性。

1.6 Hep-2细胞凋亡率观察加药后继续培养24 h，胰酶消化正常培养基终止消化后收集细胞，4℃预冷PBS洗涤细胞，1 500 r/min离心5min，重复2次，90%酒精固定－20℃保存12 h后，4℃预冷PBS洗涤细胞，1 500 r/min离心5min，重复2次，洗去酒精，制成单细胞悬液300 μL后加入PI使终浓度为10 μg/mL，室温避光孵育20min，流式细胞仪计算细胞凋亡率。数据由ModFit2.0软件系统分析。

1.7统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，均数比较采用t检验，多组数据采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1细胞存活率细胞存活率空白对照组为96.8%±1.09%，卡铂组为75.3%±0.21%，ZnPP组为84.7%±0.04%，Hemin组为101.1%± 0.13%，ZnPP联合卡铂组为54.9%±0.31%，Hemin联合卡铂组为81.1%±0.19%; ZnPP组及卡铂组明显低于空白对照组; Hemin组明显高于空白对照组; ZnPP联合卡铂组明显低于卡铂组，Hemin联合卡铂组明显高于卡铂组; P均＜0.05

2.2HO-1mRNA及HO-1mRNA蛋白表达与空白对照组比较，卡铂组和Hemin组HO-1mRNA和HO-1蛋白明显升高，ZnPP组明显下降(P均＜0.05);与卡铂组比较，ZnPP联合卡铂组HO-1mRNA和HO-1蛋白明显降低，Hemin联合卡铂组明显升高(P均＜0.05)。见表1、图1、图2。

表1　各组HO-1mRNA及蛋白相对表达(相对表达量，)

表1　各组HO-1mRNA及蛋白相对表达(相对表达量，)

注:与空白对照组比较，*P＜0.05;与卡铂组比较，#P＜0.05。

组别　HO-1mRNA　HO-1蛋白空白对照组11 ZnPP组　0.25±0.03*　0.57±0.07*Hemin组　1.82±0.11*　1.47±0.01*卡铂组　1.22±0.03*　1.23±0.10*ZnPP联合卡铂组　0.47±0.00#　0.94±0.02#Hemin联合卡铂组　1.86±0.03* #　2.35±0.12*#

图1　各组HO-图1mRNA表达

图2　各组HO-图1蛋白表达

2.3ROS相对活性空白对照组、ZnPP组、Hemin组、卡铂组、ZnPP联合卡铂组、Hemin联合卡铂组平均荧光强度分别为1、1.79±0.12、0.59±0.09、2.30 ±0.11、3.91±0.04、1.21±0.02;与空白对照组比较，卡铂组、ZnPP组ROS活性显著增高(P均＜0.05);与卡铂组比较，ZnPP联合卡铂组ROS活性明显升高，Hemin联合卡铂组明显降低(P均＜0.05)。

2.4细胞凋亡率空白对照组、ZnPP组、Hemin组、卡铂组、ZnPP联合卡铂组、Hemin联合卡铂组细胞凋亡率分别为5.15%±1.27%、11.62%±1.02%、5.01%±0.94%、20.16%±1.02%、50.67%± 2.31%、13.62%±1.29%; Hemin组与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);卡铂组、ZnPP组明显高于空白对照组(P均＜0.05); ZnPP联合卡铂组明显高于卡铂组，Hemin联合卡铂组明显低于卡铂组(P均＜0.05)。

3　讨论

喉鳞癌早期症状隐匿、生长速度快，且对放化疗的敏感度低。HO-1与肿瘤发生、发展及化疗抵抗之间的关系目前虽不甚清楚，但近年来正逐渐引起临床重视［7，8］。研究表明，HO-1在一部分肿瘤组织中呈强阳性表达，增加或降低HO-1的表达可影响肿瘤细胞的增殖与凋亡，目前在肿瘤治疗过程中合理调控HO-1的表达正逐渐成为研究的一大热点［9，10］。

Tan等［11］研究证实，在乳腺癌细胞中HO-1的高表达可促进乳腺癌细胞的增殖，促进其侵袭及转

移，其潜在机制可能与HO-1促进细胞核增殖抗原及细胞周期调控蛋白Cyclin B1等表达有关。本研究结果表明，Hemin作用于Hep-2细胞后，细胞内HO-1mRNA和蛋白水平表达上调，而应用ZnPP后细胞内HO-1mRNA和蛋白水平表达下调，细胞活性降低。提示降低HO-1表达能够抑制Hep-2细胞的生长活性。单独应用化疗药物卡铂后，细胞内HO-1表达增高，这一结果与卡铂可促进细胞内ROS活性增强有关，ROS反应水平的增高可激活下游氧化应激反应原件ARE，进而激活Nrf2诱导HO-1表达，进而减弱卡铂对于Hep-2细胞的杀伤作用。而联合应用ZnPP抑制细胞内HO-1表达后，细胞存活率下降、凋亡率显著增加。由此提示Hemin可诱导HO-1表达，对人喉鳞癌Hep-2细胞抵抗氧化应激损伤及化疗药物的杀伤存在部分保护作用，而联合应用ZnPP阻断细胞内HO-1表达后，能够增强卡铂对Hep-2细胞的杀伤作用。该机制与HO-1在白血病、肺癌、胰腺癌等实体肿瘤细胞中的报道一致［12～17］。

目前研究证实，肿瘤细胞在放化疗过程中产生的自我保护及抵抗可能与HO-1的抗氧化应激反应有关。在肿瘤细胞中抗氧化酶系统如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等均表现为下调趋势;此时，HO-1及其代谢产物成为主要的抗氧化应激反应体系［18～20］。本实验结果显示，ZnPP下调人喉鳞癌Hep-2细胞内HO-1表达后，细胞存活率降低、凋亡率升高，细胞内ROS活性增加;联合应用卡铂化疗后细胞凋亡率显著升高，细胞内ROS活性进一步增加。而当卡铂联合应用Hemin后，细胞内ROS活性及细胞凋亡率下降，由此表明HO-1可能通过调节ROS活性影响卡铂对Hep-2细胞的杀伤作用。同时也有研究报道，HO-1还可通过调节Akt途径和P21蛋白等方式影响肿瘤细胞生物学行为，但具体机制不详，还有待于进一步研究证实。

综上所述，体外抑制HO-1表达能够降低Hep-2细胞活性，增强卡铂对Hep-2细胞的杀伤作用，其具体机制可能与增强细胞内ROS活性诱导细胞凋亡有关。HO-1可能在喉鳞癌发生、发展及治疗过程中发挥重要作用，合理调控肿瘤细胞中HO-1表达有望成为喉鳞癌临床治疗的新突破。

参考文献:

［1］Chen J，Emara N，Solomides C，et al.Resistance to platinumbased chemotherapy in lung cancer cell lines［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2010，66(6): 1103-1111.

［2］Zhang K，Yang H，Wang Y，et al.Expression and significance of nrf2 and its target genes in pulmonary adenocarcinoma a549 cells resistant to Cisplatin［J］.Zhongguo Fei Ai Za Zhi，2009，12(11): 1150-1154.

［3］Wang LH，Li Y，Yang SN，et al.Gambogic acid synergistically potentiatescisplatin-induced apoptosis in non-small-cell lung cancer through suppressingNF-κB andmAPK/HO-1 signalling［J］.Br J Cancer，2014，110(2): 341-352.

［4］Furfaro AL，Piras S，Passalacquam，et al.HO-1 up-regulation: a key point in high-risk neuroblastoma resistance to bortezomib［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1842(4): 613-622.

［5］Jais A，Einwallner E，Sharif O，et al.Heme oxygenase-1drivesmetaflammation and insulin resistance inmouse andman［J］.Cell，2014，158(1): 25-40.

［6］Wagener FA，Dankers AC，van Summeren F，et al.Heme Oxygenase-1 and breast cancer resistance protein protect against heme-induced toxicity［J］.Curr Pharmdes，2013，19(15): 2698-2707.

［7］Wegiel B，Gallod，Csizmadia E，et al.Carbonmonoxide expeditesmetabolic exhaustion to inhibit tumor growth［J］.Cancer Res，2013，73(23): 7009-7021.

［8］Yun BR，LeemJ，Kim JH，et al.Enhancement of parthenolideinduced apoptosis by a PKC-alpha inhibition through heme oxygenase-1 blockage in cholangiocarcinoma cells［J］.Expmolmed，2010，42(11): 787-797.

［9］Rushworth SA，Bowles KM，Raninga P，et al.NF-kappaB-inhibited acutemyeloid leukemia cells are rescued from apoptosis by heme oxygenase-1 induction［J］.Cancer Res，2010，70(7):2973-2983.

［10］Salis O，Bedir A，Ozdemir T，et al.The relationship between anticancer effect ofmetformin and the transcriptional regulation of certain genes(CHOP，CAV-1，HO-1，SGK-1 and Par-4)onmCF-7 cell line ［J］.Eur Revmed Pharmacol Sci，2014，18(11):1602-1609.

［11］Tan Q，Wang H，Hu Y，et al.Src/STAT3-dependent heme oxygenase-1 inductionmediates chemoresistance of breast cancer cells todoxorubicin by promoting autophagy［J］.Cancer Sci，2015，106(8): 1023-1032.

［12］Chen N，Wu L，Yuan H，et al.ROS/Autophagy/Nrf2 Pathwaymediated Low-Dose Radiation Induced Radio-Resistance in Human Lung Adenocarcinoma A549 Cell［J］.Int J Biol Sci，2015，11(7): 833-844.

［13］La P，Fernando AP，Wang Z，et al.Zinc protoporphyrin regulates cyclind1 expression independent of heme oxygenase inhibition ［J］.J Biol Chem，2009，284(52): 36302-36311.

［14］Alaoui-JamalimA，Bismar TA，Gupta A，et al.A novel experimental heme oxygenase-1-targeted therapy for hormone-refractory prostate cancer［J］.Cancer Res，2009，69(20): 8017-8024.

［15］Nowisd，Bugajskim，Winiarskam，et al.Zinc protoporphyrin IX，a heme oxygenase-1 inhibitor，demonstrates potent antitumor effects but is unable to potentiate antitumor effects of chemotherapeutics inmice［J］.BMC Cancer，2008，8: 197.

［16］Mayerhoferm，Gleixner KV，Mayerhofer J.Targeting of heat shock protein 32(Hsp32)/heme oxygenase-1(HO-1)in leukemic cells in chronicmyeloid leukemia: a novel approach to overcome resistance against imatinib［J］.Blood，2008，111(4): 2200-2210.

［17］HjortsMD，AndersenmH.The expression，function and targeting of haem oxygenase-1 in cancer［J］.Curr Cancerdrug Targets，2014，14(4): 337-347.

［18］DomT，Kim HG，Khanal T，et al.Metformin inhibits heme oxygenase-1 expression in cancer cells through inactivation of Raf-ERK-Nrf2 signaling and AMPK-independent pathways［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2013，271(2): 229-238.

［19］Zhong Y，Zhang F，Sun Z，et al.Drug resistance associates with activation of Nrf2 inmCF-7/DOX cells，and wogonin reverses it bydown-regulating Nrf2-mediated cellulardefense response［J］.Mol Carcinog，2013，52(10): 824-834.

［20］KimdH，Song NY，Kim EH，et al.15-deoxy-Δ12，14-prostaglandin induces p53 expression through Nrf2-mediated upregulation of heme oxygenase-1 in human breast cancer cells［J］.Free Radic Res，2014，48(9): 1018-1027.

收稿日期:( 2015-06-30)

通信作者简介:王宝山(1963-)，男，教授，博士研究生导师，研究方向为耳鼻咽喉头颈外科学。E-mail: wbsent@126.com

作者简介:第一吕欣(1983-)，男，助理研究员，研究方向为耳鼻咽喉头颈外科学。E-mail: lvxin1983doctor@163.com

基金项目:河北省自然科学基金资助项目(H2013206264)。

文章编号:1002-266X(2015)36-0007-04

文献标志码:A

中图分类号:R739.65

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.36.003