毛细管GC法同时测定鸦胆子油乳注射液中4种脂肪酸的含量Δ

刘丹，韩飞，礼嵩，毕开顺，陈晓辉#（.沈阳药科大学药学院，沈阳006；.沈阳药大药业有限公司，沈阳 006）

鸦胆子油为苦木科植物鸦胆子Brucea javanica（L.）Merr.的干燥成熟果实经石油醚提取得到的脂肪油，其主要成分[1～7]为棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸等脂肪酸。鸦胆子油乳注射液是鸦胆子油与乳化剂制成的灭菌乳状液，临床常用于肺癌、肺癌脑转移及消化道肿瘤等多种恶性肿瘤的治疗[2]，该药与化疗药合用时可提高疗效，毒副反应少[3]。一般认为鸦胆子油制剂的临床疗效与其含有丰富的不饱和多烯脂肪酸有密切关系[4]，其中油酸具有很强的抗癌活性[5]，其他的脂肪酸成分也对人体具有重要的平衡调节作用，是不可缺少的物质，在降血脂、抗肿瘤、营养和免疫调节等方面起重要作用。建立多指标成分含量测定对中药质量控制具有重要意义。因此，笔者采用毛细管气相色谱法同时测定鸦胆子油乳注射液中棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸的含量[6]，为其质量控制提供参考。

1 仪器与试药

Agilent 7890A型气相色谱仪、氢火焰离子化检测器、DB-WAX型色谱柱（美国Agilent科技有限公司）；BP210S型电子天平（德国Sartorius公司）；HH-2型数显恒温水浴锅；SGK-5LB型氢气发生器；HGC-36A型氮吹仪。

油酸对照品（美国sigma公司，含量≥99%）；亚油酸对照品（美国sigma公司，含量≥99%）；棕榈酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：190029-201001）；硬脂酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：190032-201001）；内标物苯甲酸苯酯（上海西域机电系统有限公司，含量≥98%）；鸦胆子油乳注射液（沈阳药大药业有限公司，批号：11030411、10081311、10092911、10102411）；正己烷、甲醇和丙酮（山东禹王实业有限公司化工分公司，均为色谱纯）；三氟化硼乙醚（成都市科龙化工试剂厂，分析纯）；氯化钠、氢氧化钠、无水硫酸钠（天津市大茂化学试剂厂，分析纯）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：DB-WAX弹性石英毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；氢火焰离子化检测器（FID），柱温：200℃恒温，保持11 min；进样口温度：250℃；检测器温度：250℃；流速：1.0 mL·min－1；分流比：20∶1；载气：高纯氮；进样量：1 μL。在该色谱条件下，取对照品溶液，进样分析。理论板数按油酸甲酯计算不低于3.0×104。棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯色谱峰分离度良好，与相邻色谱峰的分离度均＞1.5。

2.2 溶液的制备

2.2.1 内标溶液的制备 取苯甲酸苯酯约100 mg，精密称定，置于100 mL容量瓶中，加正己烷定容至刻度，摇匀，制备成浓度为0.975 mg·mL－1的内标溶液。

2.2.2 对照品溶液的制备 取棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸对照品适量，精密称定，置于同一50 mL容量瓶中，加正己烷定容至刻度，摇匀，制备成棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸的浓度分别为0.335 4、0.223 8、2.923 0、0.964 0 mg·mL－1的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取供试品约1.2 g，精密称定，置于50 mL圆底烧瓶中，加稀盐酸10滴，摇匀，加氯化钠1.0 g，于65℃水浴中加热30 min，至油水分离，取出放冷至室温，精密加入正己烷振摇提取3次，每次5 mL，合并正己烷提取液，置于25 mL容量瓶中，加正己烷稀释至刻度。精密吸取正己烷溶液2 mL，置于10 mL具塞试管中，吹干，精密加入丙酮2 mL，振摇后，离心，取上层溶液l mL，置于10 mL具塞试管中，吹干。加入0.5 mol·L－1氢氧化钾甲醇溶液2 mL，置于60℃水浴皂化25 min至油珠全部消失，放冷，加15%三氟化硼乙醚甲醇溶液2 mL，置于60℃水浴酯化2 min，放冷，精密加入正己烷2 mL，振摇，加饱和氯化钠溶液2 mL，振摇，静置。取上层溶液，加0.4 g无水硫酸钠，除去微量水。精密量取上层溶液和内标溶液各l mL，摇匀，取1 μL注入气相色谱仪，即得。

2.2.4 阴性样品溶液的制备 取处方量的制剂辅料，照“2.2.3”项下方法制备阴性样品溶液。

2.3 专属性试验

取阴性样品溶液适量，进样分析，记录色谱图。在棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯及亚油酸甲酯位置均未出峰，表明制剂辅料不干扰测定。混合对照品、样品及阴性样品溶液色谱见图1。

2.4 线性关系考察

分别精密量取混合对照品溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置于具塞玻璃试管中，照“2.2.3”项下制备方法，制成系列混合对照品溶液，照“2.1”项下色谱条件进样分析。以对照品溶液浓度（X，mg·mL－1）为横坐标，内标峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯和亚油酸甲酯的回归方程分别为Y＝0.683 8X+0.014 8（r＝0.999 6）、Y＝0.731 6X+0.009 4（r＝0.999 7）、Y＝0.518 0X+0.073 0（r＝0.999 2）、Y＝0.646 6X+0.031 0（r＝0.999 1）。结果表明，棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯和亚油酸甲酯检测浓度分别在0.084～0.839、0.056～0.560、0.731～7.31、0.241～2.41 mg·mL－1范围内与其内标峰面积积分值呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

图1 气相色谱图A.对照品；B.样品；C.阴性样品；1.棕榈酸甲酯；2.硬脂酸甲酯；3.油酸甲酯；4.亚油酸甲酯；5.苯甲酸苯酯Fig 1 GC chromatogramA.reference substance；B.sample；C.negative samples；1.methyl hexadecanoate；2.methyl octadecanoate；3.methyl oleate；4.methyl linoleate；5.phenyl benzoate

精密吸取混合对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次。结果，棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸的RSD分别为0.8%、1.1%、1.1%、1.1%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取鸦胆子油乳注射液适量，各6份，精密称定，按“2.2.3”项下的方法操作，在“2.1”项色谱条件下进样分析。结果，棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸的RSD分别为2.0%、2.2%、2.4%、3.0%，表明方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液适量，室温下放置，分别于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”项色谱条件下进样分析。结果，棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸的RSD分别为1.2%、2.5%、2.1%、2.1%，表明供试品溶液24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

取鸦胆子油乳注射液（批号：11030411）共9份，每份约0.6 g，精密称定，分别精密加入相当于样品含量80%、100%、120%浓度的对照品溶液，按“2.2.3”项下的方法操作，在“2.1”项色谱条件下进样分析，计算平均加样回收率，结果详见表1～表4。

表1 棕榈酸加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1Results of recovery test of palmitic acid（n＝9）

2.9 样品含量测定

取鸦胆子油乳注射液适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定含量，结果详见表5。

3 讨论

3.1 不同极性色谱柱及程序升温的方式

分别考察了DB-1、DB-1701和DB-WAX型3种不同极性的毛细管柱。结果表明，DB-WAX型石英毛细管柱能够对样品各待测组分实现良好的分离。试验曾采用80～230℃程序升温的方式，最后确定200℃恒温测定时色谱峰达到基线分离，出峰时间合适且拖尾因子符合要求。

表2 硬脂酸加样回收率试验结果（n＝9）Tab 2Results of recovery test of octadecanoic acid（n＝9）

表3 油酸加样回收率试验结果（n＝9）Tab 3Results of recovery test of oleic acid（n＝9）

表4 亚油酸加样回收率试验结果（n＝9）Tab 4Results of recovery test of linoleic acid（n＝9）

表5 样品含量测定结果（%，n＝3）Tab 5Results of content determination of samples（%，n＝3）

3.2 影响供试品溶液制备的因素

笔者采用单因素循环的试验设计方法，以各待测组分含量为检测指标，分别考察了注射液破乳后水浴的时间（15、30、60 min），甲酯化中使用的氢氧化钾甲醇的浓度（0.2%、0.5%、1%）和酯化时间（1、2、5 min），得最佳衍生化工艺条件为：破乳后水浴30 min，加入0.5%氢氧化钾甲醇溶液皂化，再加入15%三氟化硼乙醚甲醇溶液水浴酯化2 min。在从注射液中破乳提取鸦胆子油的过程中，最后使用丙酮溶解样品，从而除去不溶于丙酮的乳化剂豆磷脂的干扰，有效地提纯了样品溶液。

3.3 注射液中辅料对脂肪酸含量测定的影响

通过制备阴性样品溶液，在“2.1项”色谱条件下进样分析。结果，在棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯及亚油酸甲酯位置均未出峰，表明制剂辅料不干扰测定。

3.4 中药注射液成分复杂，静脉滴注直接进入血液，需要严格控制其质量

现行部颁标准中仅对总酸量（以油酸作为指标成分）进行测定，不能全面反应中药的质量控制。因此，建立多指标成分含量测定对中药注射剂的质量控制具有重要意义。本试验采用毛细管气相色谱法同时对鸦胆子油乳注射液中的4种脂肪酸类成分进行了定量分析，其中抗癌活性成分油酸含量均能达到5%以上，不同批次略有差别，其他几种脂肪酸也均能达到预期含量。

综上所述，该方法快速、准确、重复性好，可为鸦胆子油乳注射液的质量控制提供参考。

[1]乔 飞，蔡 冰，余小红，等.GC测定鸦胆子油O/W型微乳中油酸的含量测定[J].江西中医药，2010，41（3）：72.

[2]卫生部.鸦胆子油乳注射液部颁标准[S].WS3-B-2739-97.

[3]党小平，陆兔林，王云锋，等.GC测定鸦胆子油软胶囊中油酸的含量[J].南京中医药大学学报，2008，24（1）：56.

[4]孔令辉，王淑丽，卢 铮，等.鸦胆子油乳颗粒剂中油酸含量测定及其稳定性考察[J].中草药，1995，26（2）：72.

[5]李福星.鸦胆子脂溶性活性成分的研究[D].南昌大学生命科学院，2006.

[6]李 盈，沈 琦，段成才，等.RP-HPLC法测定鸦胆子油中油酸和亚油酸的含量[J].中国药房，2009，20（36）：2 836.

[7]赵 军，李东峰，王建华.毛细管GC法测定黑加仑籽中γ-亚麻酸的含量[J].中国药房，2011，22（3）：251.