乳病消片定性鉴别及其延胡索乙素的含量测定

宋三孔，宋 霞，杨效宇，焦海胜

(1.兰州大学药学院，甘肃 兰州 730000;2.兰州大学第二医院药剂科，甘肃 兰州 730030)

乳病消片为兰州大学第二医院医院制剂，由柴胡、丹参、元胡、当归、淫羊藿、黄芪、茯苓等多种药材组成，具有疏肝解郁、软坚散结的功效，在医院已使用30余年，主要用于治疗乳腺炎、乳腺增生等。本试验中采用薄层色谱(TLC)法对处方中黄芪、淫羊藿、茯苓等药材进行定性鉴别，用高效液相色谱(HPLC)法测定处方中元胡药材延胡索乙素的含量，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，包括G1312A二元泵，G1315B二极管阵列检测器，G1316A柱温箱，G2170AA色谱工作站;ME2325S型电子分析天平(德国赛多利斯仪器系统有限公司);HPD－25型真空泵(天津市恒奥科技发展有限公司);ZF－C型三用紫外分析仪(上海沪粤明科学仪器有限公司);CQ50型超声波清洗器(上海超声波仪器厂)。延胡索乙素对照品(批号为 110726－200409)、淫羊藿苷对照品(批号为110737－200312)、黄芪甲苷对照品(批号为 110781－200512)，均购自中国药品生物制品检定所;硅胶G、H薄层板(青岛海洋化工厂);甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯;元胡、淫羊藿、黄芪、茯苓等药材购自甘肃方正医药有限公司，均符合2010年版《中国药典(一部)》规定;乳病消片按兰州大学第二医院制剂室工艺自制(批号分别为 20101010，20101011，20101012)。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别(薄层色谱法)

2.1.1 淫羊藿[1]

取本品 10片，研细，称取1.0 g，加70%乙醇 10 mL，超声处理30 min后过滤，滤液用水浴蒸干，残渣加1 mL乙醇溶解混匀，作为供试品溶液。称取淫羊藿苷对照品用甲醇溶解配成质量浓度为0.1 g/L的对照品溶液。另按处方制备工艺及供试品溶液制备方法制成缺淫羊藿的阴性对照品溶液。吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶H薄层板上，用乙酸乙酯－丁酮－甲酸－水(10∶1∶1 ∶1)为展开剂展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。结果供试品溶液与对照品溶液色谱在相应位置上显相同的暗红色斑点;喷三氯化铝试液，置紫外光灯(365 nm)下检视，显相同橙红色荧光斑点。而阴性对照品溶液色谱无此斑点(图1A)。

2.1.2 黄芪[2]

取本品 10片，研细，称取 2.0 g，加乙醇 30 mL，加热回流30 min后过滤，滤液用水浴蒸干，残渣加0.3%氢氧化钠溶液15 mL使之充分溶解，过滤，滤液用稀盐酸调节pH至5，每次用乙酸乙酯15 mL振摇萃取3次，取出乙酸乙酯层溶液，用铺有无水硫酸钠的滤纸过滤，滤液用水浴蒸干，残渣用1 mL乙酸乙酯溶解混匀，作为供试品溶液。称取黄芪甲苷对照品，用甲醇溶解配成质量浓度为1 g/L的对照品溶液。另按处方制备工艺及供试品溶液制备方法制成缺黄芪的阴性对照品溶液。吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－甲醇(10∶1)为展开剂展开，取出，晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰后，在紫外光灯(365 nm)下检视。结果供试品溶液与对照品溶液色谱在相应位置上显相同黄色荧光主斑点，而阴性对照品溶液色谱无此斑点(图1B)。

2.1.3 茯苓[2]

取本品10片，研细，称取2.0 g，加乙醚50 mL，超声处理10 min后过滤，滤液用水浴缓慢蒸干，残渣用1 mL甲醇溶解混匀，作为供试品溶液。称取茯苓对照药材1.0 g，按供试品溶液制备方法制成茯苓对照药材溶液。另按处方制备工艺及供试品溶液制备方法制成缺茯苓的阴性对照品溶液。吸取上述3种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，用甲苯－乙酸乙酯－甲酸(20∶5∶0.5)作为展开剂展开，取出，晾干，喷以2%香草醛硫酸－乙醇(4∶1)混合溶液，在105℃ 加热至斑点显色清晰。结果供试品溶液与对照药材溶液色谱在相应位置上色谱显相同颜色主斑点，而阴性对照品溶液色谱无此斑点(图1C)。

图1 薄层色谱图

2.2 延胡索乙素含量测定(高效液相色谱法)

2.2.1 色谱条件

色谱柱:Luna C18柱(25 mm ×4.60 mm，5 μm);流动相:甲醇 －0.1%磷酸溶液(三乙胺调 pH 至 6.5，70 ∶30);流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;检测波长:280 nm;进样量:20 μL。在此色谱条件下，理论板数按延胡索乙素峰计大于3 000。

2.2.2 溶液制备

精密称取对照品1.44 mg，加甲醇制成每1 mL含延胡索乙素0.144 mg的对照品溶液。取本品20片，研细，精密称取3.0 g，置烧瓶中，再精密加浓氨试液－甲醇(1∶20)混合溶液50 mL，称重，冷浸和加热回流依次各1 h，放冷，再次称重，用浓氨试液－甲醇(1∶20)混合溶液补足减失量，摇匀，过滤，精密量取续滤液25 mL，用水浴蒸干，残渣加甲醇3 mL使溶解，转移至5 mL容量瓶中，稀释至刻度，混匀，用0.22 μm有机膜过滤，并取续滤液，作为供试品溶液。按处方制备工艺制成缺延胡索的阴性对照品，按供试品溶液制备方法制备延胡索阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验:将2.2.2项下的对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液分别进样20 μL，色谱图见图2。可知，延胡索乙素在280 nm波长处无杂质干扰。

图2 高效液相色谱图

线性关系考察:分别精密吸取2.2.2项下对照品溶液0.25，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00 mL，置 5 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配成 7.2，14.4，28.8，43.2，57.6，72.0，86.4 μg/mL系列质量浓度，分别进样 20 μL，以延胡索乙素进样量为横坐标 X、峰面积为纵坐标 Y进行线性回归，得回归方程Y=13.306 X －42.152，r=0.999 9(n=7)。结果表明，延胡索乙素进样量在0.144～1.728 μg范围内与峰面积有良好线性关系。

稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液20 μL，按拟订的色谱条件，分别于 0，2，4，6，8，12，24 h 时进样 1 次，测定延胡索乙素的峰面积。结果的 RSD为1.42%(n=7)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

精密度试验:精密吸取同一对照品溶液20 μL，连续进样6次，测定延胡索乙素的峰面积。结果的 RSD为0.97%(n=6)，表明仪器精密度良好。

重复性试验:精密称取同一批样品，依法制备供试品溶液6份，精密吸取20 μL进样。结果延胡索乙素平均含量为0.032 9 mg/g，RSD 为 1.03%(n=6)。

加样回收试验:称取已知含量的样品(含量为0.035 4 mg/g)约 2.0 g共 6 份，各加延胡索乙素对照品溶液(0.144 g/L)0.5，0.5，2.5，2.5，3.5，3.5 mL，按供试品溶液制备方法处理后，混匀，进样20 μL测定。结果见表1。

表1 延胡索乙素加样回收试验结果(n=6)

2.2.4 样品含量测定

精密称取3批样品，依法制备供试品溶液，分别吸取20 μL进样测定，计算延胡索乙素含量。结果批号为20101010，20101011，20101012的样品中延胡索乙素含量分别为 0.032 2，0.035 4，0.036 0 mg/g(n=3)。

3 讨论

曾用乙腈 －水(55∶45)、甲醇 －水(55∶45)、甲醇 －水(70∶30)作为流动相，但分离度不好，对称性差，有明显的前沿峰，且理论板数不高;采用甲醇－0.1%磷酸溶液(三乙胺调pH至6.5，70∶30)为流动相，上述问题均得以解决。故本试验采用甲醇－0.1%磷酸溶液(三乙胺调pH至6.5，70∶30)为流动相。

乳病消片由多种药材组成，成分复杂，增加了其全面质量控制的难度。关于其质量控制方法，已有相关文献报道，多为单药材的高效液相色谱法含量测定，较零散单一。为了进一步完善该处方片剂质量控制，本试验建立了方中4种药材的定性或定量分析方法，专属性强，灵敏度高，重复性好。淫羊藿、茯苓药材薄层色谱法鉴别方法可靠，斑点显色明显。黄芪薄层色谱鉴别用氨蒸气熏蒸后斑点显色不稳定，影响重现性，故采用喷以10%硫酸乙醇溶液、105℃加热后显色，主斑点明显而持久。

[1]刘玉成，孙长文，杨红玉，等.仙灵骨葆片的薄层色谱鉴别[J].中医药学报，2006，34(2):25－26.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:224，283 －284.