EZH2在子宫内膜癌中的表达

杜善平，齐宗利，王亚琴，陈丽红，唐治国，王光华，张 健

(1陕西省人民医院，西安710068;2西安交通大学第一附属医院)

EZH2蛋白为PcG蛋白家族成员之一，是果蝇蛋白E(z)在人体的同源生物大分子［1］。近年来研究发现，EZH2与肿瘤的发生、发展密切相关［2，3］。子宫内膜癌是发生于子宫内膜的上皮性恶性肿瘤，为女性生殖器官最常见的恶性肿瘤之一，其预后与肿瘤分期、有无转移等密切相关。关于EZH2在子宫内膜癌中的表达和意义，国内外研究报道较少。本研究旨在检测子宫内膜癌组织中EZH2的表达情况，并探讨其与内膜癌临床病理特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2007年1月～2010年10月陕西省人民医院行手术及活检的子宫内膜癌患者48例，年龄28～80岁，中位年龄56岁，其中＜60岁20例，≥60岁28例;局限型19例，弥漫型29例。临床分期按国际妇产科联盟1971年标准分期，Ⅰ期12例，Ⅱ期9例，Ⅲ期23例，Ⅳ期4例;组织学类型分为:子宫内膜样腺癌45例，非子宫内膜样腺癌3例;肌层浸润≥1/2的子宫内膜癌29例，肌层浸润＜1/2的子宫内膜癌 19例;分化程度:高分化22例，中分化12例，低分化14例;23例有淋巴转移，25例无淋巴转移。所有病例在未行放疗、化疗及性激素类药物治疗前取得组织标本，由两位有经验的病理医师复查HE切片核实诊断。另取同期获取的子宫内膜正常者24例和子宫内膜增生症26例作为对照，其性别、年龄与子宫内膜癌患者差异无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化方法检测 上述组织石蜡包埋标本4μm厚切片行如下处理:浸泡于二甲苯中脱蜡、浸泡于梯度乙醇中水化，通过用高压抗原修复，3%H2O2去除非特异性过氧化物酶，正常10%山羊血清封闭。先后滴加一抗(EZH2)、二抗，试剂盒C液(过氧化物酶标记的链霉素抗生物素)、新鲜配制的DAB溶液，苏木精复染、中性树胶封片，镜下观察。以正常子宫内膜组织做阳性对照，用PBS代替一抗做空白对照。

1.2.2 原位杂交检测 切片常规脱蜡至水，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3×5 min。3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶37℃消化30 min，充分暴露mRNA核酸片段。0.5 mol、pH 7.4的PBS缓冲液振洗3×5 min。滴加阻断液，40℃作用2 h，以阻止非特异性的杂交;倾去，勿洗。滴加预杂交液，40℃作用2 h;倾去，勿洗。滴加杂交液，42℃杂交过夜。30～37℃水温的2×SSC缓冲液振洗2×15 min，滴加封闭液，37℃ 30 min;倾去，勿洗。滴加抗地高辛抗体碱性磷酸酶复合物，37℃ 60 min。0.5 mol、pH 7.4 的PBS 缓冲液振洗4 ×5 min。DBA显色，苏木精衬染，盐酸乙醇分化，脱水透明，封片，以正常子宫内膜组织做阳性对照，预杂交液代替杂交液做阴性对照。

1.2.3 光镜观察 免疫组织化学染色EZH2主要定位于细胞核，但部分细胞质也有着色，细胞核或细胞质内出现明显棕黄色颗粒者为阳性细胞。原位杂交检测EZH2主要是以胞质着色为主。二者采用统一的评价标准［4］，根据染色细胞百分率及染色强度进行评定。

1.2.5 统计学方法 采用SSPS13.0软件包，不同组织间EZH2表达比较采用χ2检验、Fisher精确概率法检验以及多因素Logistic回归分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三种组织间EZH2的表达 48例子宫内膜癌中，EZH2蛋白及EZH2 mRNA的表达阳性率分别为70.8%(34/48)、64.6%(31/48);24 例子宫内膜正常组织中EZH2蛋白及EZH2 mRNA的表达阳性率为16.7%(4/24)、12.5%(3/24);26 例子宫内膜增生症中EZH2蛋白及EZH2 mRNA的表达阳性率为23.1%(6/26)、19.2%(5/26)。三种组织间 EZH2蛋白及EZH2 mRNA表达阳性率比较有统计学差异(P 均 ＜0.01)。

2.2 EZH2表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系 见表1。

表1 EZH2蛋白和EZH2 mRNA表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系

2.3 EZH2蛋白表达相关的多因素分析 多因素分析显示淋巴转移、临床分期及肌层浸润与EZH2蛋白阳性表达有关(P均＜0.05)，与肿瘤的病理分级及大体类型无关(P＞0.05)。见表2。

表2 EZH2蛋白表达相关的多因素分析

3 讨论

研究表明，EZH2表达水平与许多肿瘤的侵袭、转移密切相关，随着肿瘤的恶性演进，EZH2蛋白的表达增高［5～7］。Raman等用 RT-PCR 研究 38例膀胱组织标本中EZH2 mRNA的表达情况，发现14例非瘤性膀胱组织中有5例EZH2 mRNA表达阳性，膀胱癌组织24例中有21例EZH2 mRNA表达阳性二者相比有统计学差异。同时发现在浸润性膀胱癌中其表达率为100%，而在非浸润性膀胱癌中其表达率为79%;并且EZH2 mRNA表达和病理分级呈正相关。与此同时，Ramman等用免疫组织化学对39例膀胱癌中EZH2蛋白表达分析发现，EZH2蛋白的表达情况基本与EZH2 mRNA表达一致，但浸润性膀胱癌和非浸润性相比EZH2蛋白的表达水平无统计学差异，而且正常膀胱组织与低级别的膀胱癌组织相比EZH2蛋白的表达水平无统计学差异，而与高级别的膀胱癌组织相比EZH2蛋白表达有统计学差异。

本研究发现，在子宫内膜癌中EZH2蛋白的阳性表达率显著高于正常子宫内膜和增生症子宫内膜，并且单因素分析表明，淋巴结转移、临床分期、肌层浸润深度、细胞分化程度及肿瘤是否局限与EZH2蛋白的表达显著相关，而多因素分析结果显示EZH2蛋白的表达只与淋巴结转移、临床分期及肌层浸润深度相关，这与在其他恶性肿瘤中的研究结果基本一致，提示EZH2蛋白的高表达与内膜癌的恶性程度相关。

由于本研究属于回顾性研究，采用的原位杂交及免疫组织化学检测方法敏感性较RT-PCR差，因此关于EZH2是否可以用于预测内膜癌的恶性程度尚需进一步研究。另外，内膜癌中EZH2与年龄及病理分型无显著相关性，究其原因可能是由于其他的子宫内膜癌样本量太少，不足以显示差别，还需要进一步实验验证。

到目前为止，EZH2的作用机制还不是很明确。EZH2蛋白具有组蛋白H3甲基转移酶活性、组蛋白去乙酰基转移酶(HADC)和基因外的多种调控作用，其生物活性的发挥依赖于HDAC活性及完整的SET结构域，通过组蛋白乙酰化抑制剂(如TSA)可以消除其效果，因此推测其可能作用机制是EEDEZH2复合物→HDAC+SET→转录抑制→基因沉默，并且提示HDAC抑制剂将成为EZH2高表达肿瘤的新的治疗方案［8］。最近研究发现，周期素依赖性激酶1介导的EZH2磷酸化可调节其稳定性，主要是磷酸化的EZH2促使其泛素化，最终被降解，从而不利于细胞增殖，这种调控机制对药物治疗提供了新的思路［9］。也有研究发现病毒对EZH2有激活作用，从而促进肿瘤不断增殖［10］。

总之，本研究结果显示，子宫内膜癌中EZH2的表达与淋巴结转移、临床分期显著相关，并对预后有一定的影响。对EZH2在子宫内膜癌发生、发展中的作用研究将有助于揭示子宫内膜癌发生机制，并可以发现更多的治疗靶点，从而有利于为子宫内膜癌患者选择个体化治疗方案。

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