纳米材料PEG-PEI介导双基因促体外拟神经细胞凋亡的作用

梁 兵，袁 芳，殷建瑞，蒲蜀湘，解龙昌，高庆春，高 聪

(广州医学院第二附属医院，广州510260)

在基因治疗研究领域，载体问题一直是最重要的核心问题之一。我们前期合成并检测了叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺(PEG-PEI)在几种叶酸表达丰富细胞中的基因转染效率及细胞毒性作用，证实PEG-PEI可以作为胶质瘤基因治疗的优良转染载体［1～3］。但PEG-PEI这种新型纳米材料对于拟神经细胞(神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞)的转染效果尚不明确。2010年10月～2011年12月，我们在体外观察了PEG-PEI介导CD和TRAIL基因联合转染SH-SY5Y细胞的细胞杀伤作用，以寻找神经系统疾病基因治疗的有效方法。

1 材料与方法

1.1 质粒DNA(pDNA)的制备 应用前期合成的能表达绿色荧光蛋白的pIRES2-EGFP/CD-5-FC和pIRES2-EGFP/TRAIL质粒，将质粒在大肠杆菌中扩增，然后用QIAGEN试剂盒提取纯化，得到的质粒通过紫外分光光度计在260、280 nm波长处检测其含量;在1.0%的琼脂糖凝胶上以100 V电压电泳40 min，检测其完整性。检测合格的质粒保存于－20℃备用。

1.2 细胞培养 将人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞(购自ATCC)置于10%胎牛血清DMEM完全培养液中，单层培养法传代培养生长至所需的细胞数，在接种前再传代1次，24 h后更换1次培养液。在细胞于对数生长期大约80%时，以0.25%胰酶消化，收集消化液离心后去除上清液，Hanks液吹打冲洗2次后以Hanks液制成细胞悬液，调节细胞浓度为1×106/10μL Hanks液，置于37℃水浴待接种。台盼蓝排斥实验检测细胞活力＞95%。

1.3 PEG-PEI/pDNA复合物的制备 在Eppendorf管中，将总量1μg的pDNA稀释在50μL不含FBS的DMEM中，振荡均匀，按不同N/P比(即PEG-PEI/pDNA比)把相应量的PEG-PEI加入到另外一管装有50μL不含FBS的DMEM的Eppendorf管中，然后把两溶液在室温下振荡5 min得到均匀复合物。

1.4 MTT法细胞凋亡检测 SH-SY5Y细胞以每孔6×103接种在96孔板中，24 h后每孔加入含有300 ng质粒的PEG-PEI/pDNA复合物(其中先检测N/P=5～30时，质粒为 pIRES2-EGFP/CD-5-FC和pIRES2-EGFP/TRAIL;之后再检测 N/P=15时，质粒分别为 pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP/CD-5-FC、pIRES2-EGFP/CD-5-FC+pIRES2-EGFP/TRAIL以及 pIRES2-EGFP/TRAIL)的 150μL无血清的DMEM培养液进行转染，4 h后改为完全培养基，同时加入10μg/mL的5-FC，每个浓度复制在4个孔中。72 h之后加入20μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h，小心吸出孔内培养上清液后，加入100 μL DMSO，室温振荡5 min后，通过化学发光酶标仪测定570 nm处的吸光度值。

1.5 倒置荧光显微镜细胞凋亡观察 将SH-SY5Y细胞以每孔1×105个接种在24孔板上培养24 h，待细胞丰度70%，在转染前4 h用不加 FBS的DMEM培养基置换培养液;然后把其吸走后每孔加入含有1μg pDNA不同N/P比的复合物和200μL不含FBS的DMEM培养基。在37℃下培养4 h，吸去转染液，加入完全DMEM培养基在37℃下继续培养20 h。按N/P=15计算，将4组质粒pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP/CD-5-FC、pIRES2-EGFP/CD-5-FC+pIRES2-EGFP/TRAIL以及pIRES2-EGFP/TRAIL(质粒总量各为1μg)分别同纳米材料复合后对SH-SY5Y细胞转染，4 h后改为完全培养基，同时加入10μg/mL的5-FC，每个浓度复制在4个孔中。72 h之后弃去上层培养液，通过倒置荧光显微镜观测pDNA在SH-SY5Y细胞中的转染效果及细胞存活情况，照片用Nikon荧光软件捕获。

1.6 流式细胞仪细胞凋亡检测 如上述准备好细胞后，按N/P=15计算，将4组质粒pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP/CD-5-FC、pIRES2-EGFP/CD-5-FC+pIRES2-EGFP/TRAIL以及pIRES2-EGFP/TRAIL(质粒总量各为1μg)分别同纳米材料复合后对SHSY5Y细胞转染，4 h后改为完全培养基，同时加入10μg/mL的5-FC，每个浓度复制在4个孔中。72 h之后弃去上层培养液，细胞用500μL Hanks平衡盐溶液悬浮，然后应用FACSAria TM系统计数凋亡细胞的百分比。

1.7 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件，计数资料以百分比表示，不同处理方式间的差异性采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法细胞凋亡检测结果 除去高浓度纳米粒子的毒性作用，在N/P=15时PEG-PEI转染两种目的基因中单一基因的细胞凋亡作用最强(P＜0.01)，见图1。而在不使用纳米材料的情况下，两种基因的细胞凋亡作用几乎可以忽略不计。当两种基因联合转染SH-SY5Y细胞时，其促细胞凋亡作用明显提高，细胞凋亡率达到77%，比单一基因提高了27%(P ＜0.01)，见图2。

2.2 倒置荧光显微镜细胞凋亡观察结果 在N/P=15时，将两种PEG-PEI/基因复合物在SH-SY5Y细胞中进行转染，然后分别用倒置荧光显微镜观测。在EGFP空白质粒组中，绿色荧光很多，细胞密度很高，提示细胞凋亡数很少(图3-A)。在两种 PEGPEI/基因复合物单独转染组中，绿色荧光较少，细胞密度不高，提示细胞凋亡数较多(图3-B、C)。而在两种PEG-PEI/基因复合物联合转染组中，绿色荧光很少，细胞密度很低，提示细胞凋亡数很多(图3-D)。这一结果与MTT法得到的结果一致。

图1 不同N/P比时PEG-PEI/基因复合物在SH-SY5Y细胞中的促细胞凋亡作用

图2 N/P=15时PEG-PEI/基因复合物在SH-SY5Y细胞中的促细胞凋亡作用

图3 倒置荧光显微镜观测N/P=15时PEG-PEI/基因复合物在SH-SY5Y细胞中的促细胞凋亡作用

2.3 流式细胞仪细胞凋亡检测结果 在N/P=15时，将两种PEG-PEI/基因复合物在SH-SY5Y细胞中进行转染，然后分别用流式细胞仪检测。在EGFP空白质粒组中，仅8%的细胞凋亡，见图4。在两种PEG-PEI/基因复合物单独转染组中，有大约45%的细胞凋亡，而在两种PEG-PEI/基因复合物联合转染组中，细胞凋亡比例高达75%。联合基因转染细胞促凋亡能力明显高于单基因转染(P＜0.01)。这一结果与上述得到的结果一致。

图4 流式细胞仪检测N/P=15时PEG-PEI/基因复合物在SH-SY5Y细胞中的促细胞凋亡作用

3 讨论

神经母细胞瘤是儿童中第2种常见的实体瘤，占青少年肿瘤发病率的10%，属于神经嵴来源的恶性胚胎瘤。1970年12月Tumilowicz等建立了SHN-SH细胞系，其来源于1次骨髓活检。SH-N-SH细胞系分为3个亚型:神经瘤型亚克隆SH-SY5Y、非神经元型有很强基质附着性的亚克隆SH-EP和介于两者之间的亚克隆SH-IN。SH-SY5Y中含有凋亡相关酪氨酸激酶，在调节神经系统发育过程中发挥重要作用，能够诱导SH-SY5Y的分化，并且能增强其他诱导分化物的作用。作为拟神经细胞模型，SH-SY5Y细胞系广泛应用于神经系统疾病的发病机制和防止措施的研究中。人神经母细胞瘤株SHSY5Y细胞系是一种分化程度较低的肿瘤细胞，属于神经瘤型亚克隆，因此SH-SY5Y细胞繁殖快。由于其细胞形态、生理和生化功能与正常神经细胞相似，故被广泛应用于神经系统疾病发病机制和药物作用机制方面的研究。临床上很多神经系统疾病与细胞凋亡有关，SH-SY5Y是研究神经元凋亡的最常用细胞模型。同时SH-SY5Y细胞在全反式维甲酸作用下可分化为神经元表型的细胞，是一个研究神经系统生理病理很好的细胞模型。

分子生物学的发展证实，神经系统疾病的发生与细胞的基因性病变有关。基因治疗被认为是从根本上治疗甚至最终攻克神经系统疾病的最有希望的途径之一，常用的途径包括自杀基因治疗、控制细胞周期及诱导凋亡、免疫基因治疗、抗血管生成基因治疗以及应用溶瘤病毒等［4］。由于神经系统疾病的产生多存在异源性，即涉及到多个基因(有时还涉及到未明基因)，单纯地阻断或下调某一种(有时甚至几种)基因的表达，往往仍然不能获得理想的效果，因此联合基因治疗研究近年发展较快。联合基因治疗可弥补单一基因治疗的不足，提高基因治疗的疗效，是神经系统疾病基因治疗的趋势之一［5］。

自杀基因是来自某些病毒或细菌的基因，可编码特定的酶，正常哺乳动物细胞缺乏这种基因，如果将其导入靶细胞中，可使无毒性的前体药物转化为细胞毒性代谢产物干扰DNA合成，从而导致靶细胞死亡［6］。自杀基因治疗系统的种类较多，主要包括单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶—丙氧鸟苷系统、带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶—阿糖甲氧基嘌呤系统、胞嘧啶脱氨酶-5-氟胞嘧啶系统、硝基还原酶-CB1954系统等。经典自杀基因一般编码非哺乳动物酶类，可将无毒的前药转变为高毒性代谢产物。其中胞嘧啶脱氨酶(CD)系由大肠杆菌和某些霉菌表达的一种酶，只存在于细菌、真菌体内，蛋白分子量为52 kD，可促使5-氟胞嘧啶脱氨，转化为5-氟尿嘧啶。5-氟尿嘧啶经细胞代谢成为5-氟-2-脱氧尿嘧啶核苷酸，可抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧尿嘧啶核苷酸转变为胸腺嘧啶核苷酸，从而抑制细胞DNA、RNA和蛋白的合成，导致细胞死亡。因此CD基因是肿瘤基因治疗中应用最多最重要的药物敏感靶基因之一。同时几乎所有的自杀基因治疗系统都存在“旁观者效应”。不少研究表明，只要少量的自杀基因转染的癌细胞与未转染的癌细胞按一定比例混合后共同培养，不仅转染的癌细胞被杀死，二者相互接触后相邻的未转染的癌细胞也大量死亡，即“旁观者效应”，而几乎所有的自杀基因治疗系统都存在这种效应［7］。目前，CD/5-FC自杀基因系统作为一种新型自杀基因治疗系统越来越多地受到关注，并已应用于多种恶性实体肿瘤的基因治疗研究［8，9］。研究表明，自杀基因疗法与其他基因疗法联合应用有良好的疗效，相互协调，可增加抗肿瘤效果，已成为目前研究的发展方向。近年研究发现，TRAIL具有选择性诱导肿瘤细胞发生凋亡的特性，而对正常组织无损伤作用，因此在肿瘤治疗中具有巨大潜力［10，11］。

安全高效的基因传输载体是实现基因治疗的关键之一。阳离子纳米材料易于合成和改性、无免疫原性等优点使其成为非病毒基因载体的一种重要类型;但由于其对细胞有正电荷相关的毒性、转染效率较病毒载体低、缺乏传输特异性等缺点制约了其在临床上的应用。为了确认PEG-PEI在SH-SY5Y细胞中转染含目的基因的重组质粒的效率，我们先检测了不同N/P比时PEG-PEI/pIRES2-EGFPCD-5-FC以及PEG-PEI/pIRES2-EGFP/TRAIL基因复合物的促细胞凋亡能力，结果证实在N/P=15时PEG-PEI转染的两种目的基因各自的细胞抑制作用最强。而在两种基因联合转染SH-SY5Y细胞时，其细胞凋亡作用明显提高，提示两者联合应用通过抑制细胞毒性和诱导细胞凋亡提高了细胞凋亡作用。为了更精确检测两种PEG-PEI/基因复合物在SH-SY5Y细胞中的细胞凋亡能力，在N/P=15时，将两种PEGPEI/基因复合物在SH-SY5Y细胞中进行转染，然后分别用倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测。结果发现联合基因转染细胞生长抑制能力明显高于单基因转染，进一步证实了MTT法的研究结果。

由此可以得出结论，PEG-PEI介导的CD-5-FC/TRAIL联合基因转染在SH-SY5Y细胞中具有很强的促细胞凋亡能力，PEG-PEI可以进一步用于体内神经系统疾病基因治疗的研究。

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