白藜芦醇对老年大鼠心肌细胞线粒体细胞色素C氧化酶表达的影响

夏立志 胡秋玲 (哈尔滨市二四二医院，黑龙江 哈尔滨 150066)

随着人口老龄化，提高老年人的生活质量，延缓衰老一直是医学界研究的热点。线粒体在进行有氧呼吸时，伴有自由基的产生，将引起衰老。因此，清除自由基、保护线粒体的天然药物对于抗衰老发挥重要作用〔1〕。白藜芦醇对动脉粥样硬化有保护作用，具有清除自由基、抗脂质过氧化等作用〔2〕，但白藜芦醇对老年大鼠心肌线粒体能量代谢的影响未见报道。本实验旨在为抗衰老药物开发提供实验依据，同时为老年心脏病患者的康复奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 纯系雄性SD大鼠30只，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供，3月龄大鼠10只作为青年组，体重(300±41.5)g;24月龄大鼠20只，体重(700±83.5)g，随机分为老年组和用药组，每组10只。室温饲养，自由饮食。

1.2 药物与处理 白藜芦醇由本实验室从虎杖中提取(99%，HPLC)，白藜芦醇标准品由 sigma公司提供，实验时用蒸馏水配成混悬液。用药组每日予白藜芦醇(70 mg/kg)连续灌胃4 w。每周称重2次，根据体重调整剂量。青年组和老年组均灌胃等容量生理盐水。

1.3 指标测定

1.3.1 心肌线粒体的提取 给药4 w后断髓处死。迅速取出心脏，一部分液氮冻存，用于提取组织 RNA。另外部分剪成小块后立即用介质Ⅰ(0.25 mol/L蔗糖溶液，3.0 mmol/L HEPES，0.5 mmol/L EDTA，pH7.4)去除血污，用滤纸吸去表面的液体，称重，匀浆，600 r/min离心5 min，取上清液于10000 r/min离心10 min。沉淀用介质Ⅱ(0.25 mol/L蔗糖溶液，2.0 mmol/L HEPES，0.5 mmol/L EDTA，pH7.4)悬浮，10000 r/min 离心10 min，沉淀悬浮在0.5 ml介质 Ⅱ 中，制备成线粒体悬液备用〔3〕。另一部分线粒体悬液经超声波粉碎机粉碎，400 A，5 s/次，间隙 10 s，反复 4次使线粒体微粒破碎，4℃ 离心(2000 r/min，10 min)，取上清液供酶活力测定。以上操作皆在4℃ 以下进行。另一部分线粒体悬液直接供丙二醛(MDA)与蛋白质的测定。

1.3.2 测定方法 心肌线粒体蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G250法;超氧化物歧化酶(Mn－SOD)活性的测定采用黄嘌呤氧化酶法;心肌线粒体MDA含量的检测采用硫代巴比妥酸(TBA)法;线粒体呼吸链酶复合体Ⅳ(CoⅣ)活力测定采用王学美等〔4〕的方法。CoⅣ mRNA表达采用 RT－PCR方法，CoⅣ和甘油醛－3－磷酸脱氨酸(GAPDH)引物序列用Prime软件进行设计，并由上海生工合成，CoⅣ引物序列:上游:5′ACTACCCCTTGCCTGATGTG3′，下 游:5′ACTCATTGGTGCCCTTGTTC3′，扩增产物长度 171 bp;内参照 GAPDH:上游:5′CCACCACCATCTTCCAGGAG3′，下 游:5′CCTGCTTCACCACCTTCTTG3′，扩增产物长度572 bp。用 Trizol试剂盒 (上海生工生物公司)提取细胞总RNA，用逆转录试剂盒(大连TaKaRa公司)进行逆转录合成cDNA;以GAPDH为内对照，进行半定量逆转录聚合酶链反应。反应条件为:94℃ 预变性3 min后，94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共进行 30 次循环，最后72℃ 延伸5 min，4℃ 冷却终止反应。以 GAPDH为内参照同时进行PCR。聚合酶链反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。用GDS8000凝胶扫描分析系统分别对CoⅣ和GAPDH进行吸光度扫描，计算出CoⅣ基因表达量与GAPDH基因表达量的比值。

1.4 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行分析，所有测定指标均采用±s表示，多组数据组间比较采用F检验和q检验，两组数据比较采用t检验。

2 结果

2.1 白藜芦醇对大鼠心肌线粒体内Mn－SOD活力和MDA含量及CoⅣ活性的影响 与青年组比较，老年组大鼠心肌线粒体内Mn－SOD的活性降低，CoⅣ活性降低，MDA含量增加;与老年组比较，用药组Mn－SOD活性增加，CoⅣ活性增加，MDA含量降低。见表1。

2.2 白藜芦醇对老年大鼠心肌COⅣmRNA水平影响 各组在分子量171 bp处均出现DNA条带。与青年组(1.34±0.158)相比，老年组CoⅣmRNA水平(3.75±0.26)显著升高(P＜0.05);用药组(2.48±0.19)与老年组比较，CoⅣ mRNA表达减低(P＜0.05)，差异均有统计学意义。见图1。

表1 白藜芦醇对大鼠心肌线粒体内Mn-SOD活力、MDA含量和CoⅣ活性的影响( ± s，n=10)

表1 白藜芦醇对大鼠心肌线粒体内Mn-SOD活力、MDA含量和CoⅣ活性的影响( ± s，n=10)

与老年组比较:1)P＜0.05;2)P＜0.001

组别Mn－SOD 活性(U/mg)MDA(nmol/mg)CoⅣ活性(μmol·min－1·mg－1青年组 46.25±4.041) 63.38±5.041) 2468.58±405.342)老年组 20.47±2.18 95.74 ±8.36 937.56±248.99用药组 43.69±3.821) 76.65±7.371) 1983.46±402.532)

图1 白藜芦醇对老年大鼠心肌CoⅣmRNA表达的影响

3 讨论

近年的研究发现自由基引起的生物膜脂质过氧化与衰老密切相关。Mn－SOD是一种存在于细胞线粒体中的能够清除超氧化物自由基的酶，但随着年龄的增加，机体细胞内Mn－SOD活性减弱，由于抗氧化物质产生的减少，脂质过氧化中间产物MDA增加〔5〕，将导致机体衰老。本研究结果发现，与青年组比较，老年大鼠MDA含量增加，Mn－SOD活性减低。使用天然药物白藜芦醇后，能显著提高老年大鼠心肌线粒体Mn－SOD活力，减低MDA含量，机制可能为:①白藜芦醇具有抗氧化成分，可直接中和氧自由基，使 Mn－SOD消耗减少，活力上升;②白藜芦醇可能具有刺激SOD活性的组分，使其活力增加;③白藜芦醇有效的抗氧化成分直接抑制线粒体膜的脂质过氧化反应，使MDA含量降低。

线粒体内膜上的呼吸链通过生物氧化产生机体需要的能量。CoⅣ是呼吸链酶中的关键酶，其酶活性变化直接影响整个呼吸链的功能变化，CoⅣ又是最不稳定、最脆弱、最易受损的酶，尤其易受自由基氧化损伤，引起电子传递过程中电子漏失，电子传递效率下降，自由基产生增多，进一步影响呼吸链功能，使ATP合成进一步减少，最终造成不可逆的损伤〔6～9〕。本研究结果表明，老年大鼠的心肌线粒体CoⅣ活性降低，在给予白藜芦醇后，酶复合物的活性有所提高。进一步分子生物学研究发现，老年大鼠CoⅣmRNA表达增加，白藜芦醇干预后CoⅣmRNA表达降低，分析原因可能是为了维持机体正常代谢所需的能量，而产生更多的辅酶蛋白补充，从而刺激CoⅣ表达增加。

以上的研究提示，白藜芦醇通过增强机体的抗氧化作用，减少氧化产物对辅酶功能的损伤，从而使辅酶活性提高，进而降低对CoⅣmRNA水平反馈调节，以维持线粒体功能，进而改善心肌的能量代谢。

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