Slug和E－cadherin在结直肠癌组织中的表达及临床意义

钱 江 陈旺盛 文坤明 傅仲学 王素梅 (重庆医科大学附属第一医院普通外科，重庆 40006)

Slug作为Snail锌指转录因子家族成员之一，有高度保守的C2H2型锌指结构域，通过连接到E－box以抑制靶基因的转录。上皮细胞钙黏蛋白(E－cadherin)是上皮组织中类依赖Ca2+的细胞间粘连跨膜糖蛋白分子，可以在胞浆内形成E－钙黏蛋白－β－连环蛋白－α－连环蛋白复合体，此复合体再直接连接到肌动蛋白细胞骨架上，用以维持细胞间黏附的稳定性和细胞的极性。Slug是E－cadherin启动子的抑制子，参与控制细胞分化和凋亡的不同进程。本研究探讨Slug和E－cadherin的表达与结直肠癌的发生、发展作用以及Slug和E－cadherin之间有无相关性，为诊断、治疗、预防结直肠癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2003年1月至2004年3月重庆医科大学附属第一医院住院接受手术治疗的结、直肠癌患者65(男37，女28)例，年龄24～83(中位62)岁，全部病例均经病理证实。其中结肠癌39例，直肠癌26例;高中分化腺癌36例，低分化腺癌29例;有淋巴结转移者30例，无淋巴结转移者35例。Dukes分期:A+B期31例，C+D期34例。另取癌旁组织(距癌组织5 cm以上)25例作为对照组。所有病例术前均未行放化疗及免疫治疗。所有标本均经过甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，常规HE染色。65例患者无住院期间死亡，随访日期从患者术后第1日开始计算，随访至2010年1月，随访时间6～60个月、失访3例。试剂:鼠抗人Slug单克隆抗体(SC－166476)购自美国 Santa Cruz公司，鼠抗人 E－cadherin单克隆抗体(SC－7963)购自美国Santa Cruz公司，即用型SABC免疫组化染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法 石蜡切片脱蜡至水;滴加一抗的组织切片用EDTA缓冲液高压热修复10 min，修复后的切片在缓冲液中冷却后，滴加过氧化物酶阻断溶液;用50～100 ml正常山羊血清封闭，滴加一抗，工作浓度为1∶100，4℃冰箱孵育过夜;滴加生物素标记的第二抗体，滴加链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液;DAB显色;以PBS代替一抗作阴性对照。

1.2.2 结果判定 根据染色程度和染色细胞百分比进行评分，染色阳性信号以细胞核和细胞质着色为准，呈棕黄色颗粒，细胞染色强度明显高于背景呈棕黄色者为阳性细胞。按切片中阳性细胞比例分别记0～4分:在5个高倍视野下，切片中阳性细胞≤5%为0分，6% ～25%为1分，26% ～50%为2分，51%～75%记3分，＞75%为4分;按染色深浅分别为0～3分，染色深度以多数细胞为准，无阳性细胞为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;免疫反应的得分为阳性细胞的百分率得分与免疫染色的强度得分的乘积，再按这两项指标的总积分将结果分成4级:0分为(－)，1～2分为(+)，3～4分为()，5～12 分为()。其中(－)和(+)为低表达，()和()为高表达。

1.3 统计学处理 以SPSS 13.0统计软件包进行χ2检验，Kaplan－Meier法计算生存率，Log－rank检验，单因素Cox回归分析，Cox比例风险模型多因素分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Slug和E－cadherin蛋白在不同组织中的表达 Slug位于结直肠癌组织的细胞质中，阳性率为47.1%，在正常大肠黏膜组织中几乎无表达，正常大肠黏膜E－cadherin定位于上皮细胞膜，大肠癌组织中 E－cadherin胞膜表达不同程度缺失，为55.4%。见图1。

图1 Slug和E-cadherin在结肠的表达(DAB，×200)

2.2 Slug和E－cadherin蛋白表达与结直肠癌临床病理特征的关系 Slug蛋白异常表达与肿瘤部位、肿瘤大小相关性不显著，而与浸润深度、分化程度、淋巴结转移、Dukes分期相关性均有统计学意义(P＜0.05)。E－cadherin蛋白阳性表达与肿瘤部位、肿瘤大小相关性不显著，而与浸润深度、分化程度、淋巴结转移、Dukes分期相关性均有统计学意义(P＜0.05)，表1。

2.3 结直肠癌中Slug和E－cadherin蛋白表达相关性 经统计分析在结直肠癌中Slug阳性表达32例，其中E－cadherin表达缺失13例;Slug阴性表达33例，其中E－cadherin表达缺失23例，二者表达无相关性(P=0.644)。

2.4 生存分析 Slug阳性表达患者生存时间明显短于Slug阴性表达患者(P＜0.05);E－cadherin膜表达缺陷患者生存时间明显短于有E－cadherin表达缺陷患者(P＜0.05)，见图2。

2.5 Cox比例风险模型多因素分析 先用单因素Cox模型对肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移、Dukes分期、浸润深度、肿瘤大小进行初步筛选，然后用Cox多因素分析，统计分析表明 Slug、E－cadherin、淋巴结转移、Dukes分期可成为影响结直肠癌预后的独立因素(P＜0.05);其中Slug相对危险度为2.832(P=0.000)，E－cadherin相对危险度为2.741(P=0.007)，见表2。

图2 Slug和E-cadherin表达患者生存曲线

表1 Slug和E-cadherin的表达与临床病理因素的关系〔n(%)〕

表2 结直肠癌患者预后多因素分析

Slug高表达参与了结肠癌的发生、发展和转移，与文献报道基本一致〔1〕。但与Martin等〔2〕研究乳腺癌Slug表达与TNM分期无明显相关不一致，可能所涉及信号通路不同有关。Slug高表达也预示着结直肠癌患者有较高的淋巴结转移率，提示病人的预后不佳，其测定同样有助于早期判断预后。本研究提示Slug的高表达与肿瘤转移密切相关，且是影响结直肠癌预后的独立因素。

E－钙黏蛋白(E－cadherin)是一种单跨膜糖蛋白，能在细胞与细胞黏附中以同种分子间，拉链式结合形式介导细胞黏附，研究证实在绝大多数恶性肿瘤中如乳腺癌、肠癌、结直肠癌、前列腺癌、肝癌、食管癌、皮肤癌、肾癌和肺癌都存在有上皮－间叶变(EMT)造成E－cadherin表达下调，并导致介导的细胞－细胞间黏附功能削弱或丧失〔3〕，并致肿瘤细胞极易脱离原发灶且易于向周围组织侵袭，为肿瘤的远处转移提供了必要的条件。本研究提示E－cadherin异常表达可能与结肠癌的发生有关。邱雪彬等〔4〕研究认为E－cadherin表达与某些肿瘤的分化程度有关，而本研究提示 E－cadherin可能参与调控结肠癌的分化。Nabeshima等〔5〕研究发现肿瘤细胞的侵袭能力与 E－cadherin表达有关，而在人体实体瘤的研究中也发现非小细胞肺癌〔4〕、舌癌〔6〕中E－cadherin异常表达与肿瘤转移密切相关。本文显示E－cadherin膜表达缺失与结肠癌浸润、转移密切相关，表明E－cadherin具有抑制肿瘤侵袭的功能，且是影响结直肠癌预后的独立因素。这可能与结肠癌E－cadherin膜表达缺失病例较易发生浸润、转移而影响预后有关。本研究还表明，Ecadherin和Slug的表达均与病人肿瘤部位、肿瘤大小无关。本实验Ecadherin和Slug蛋白表达相关性分析显示，Ecadherin和Slug表达无相关性，这与Shioiri等〔7〕研究结果一致，这种相关性的缺乏可能是由于在结直肠癌中E－cadherin下调常常是通过启动子的超甲基化的作用而不是通过基因结构的改变引起〔8〕。

1 Zhang KJ，Zhang BY，Zhang KP，et al.Clinicopathologic significance of slug expression in human intrahepatic cholangiocarcinoma〔 J〕.World J Gastroenterol，2010;16(20):2554－7.

2 Martin TA，Goyal A，Watkins G，et al.Expression of the transcription factors snail，slug，and twist and their clinical significance in human breast cancer〔J〕.Ann Surg Oncol，2005;12(6):488－96.

3 黄 菊，程夏楷，杨 彬，等.E－钙黏蛋白复合体及其对肿瘤细胞的作用〔J〕. 生命的化学，2005;25(3):247－50.

4 邱雪彬，杨 秀，李庆昌，等.上皮性钙黏附蛋白和β－连环素的表达与非小细胞肺癌预后的关系〔J〕.中华病理学杂志，2002;31(4):318－21.

5 Nabeshima K，Inoue T，Shimao Y，et al.Cohort migration of carcinoma cell:differetiated colorectal carcinoma cells move as coherent cell clusters or sheets〔J〕.Histol Histopathol，1999;14(6):1183－97.

6 郑天荣，李建成，刘秀英.E－钙黏附素和CD44v6在舌癌中的表达及其意义〔J〕. 诊断病理学杂志，2002;9(2):98－9.

7 Shioiri M，Shida T，Koda K，et al.Slug expression is an independent prognostic parameter for poor survival in colorectal carcinoma patients〔J〕.Br J Cancer，2006;94:1816－22.

8 Garinis GA，Menounos PG，Spanakis NE，et al.Hypermethylation－associated transcriptional silencing of E－cadherin in primary sporadic colorectal carcinomas〔J〕.Pathol，2002;198:442－9.