溶酶体蛋白酶cathepsin L在阿尔茨海默病模型大鼠海马组织中的表达及意义

郭燕君 (嘉兴学院医学院，浙江 嘉兴 314001)

人类cathepsin L基因定位于第9号染色体9q21-22，属于半胱氨酸蛋白酶的家族成员之一，是一种广泛存在的嗜酸性溶酶体蛋白水解酶。翻译后N-端糖基化，利用6-磷酸-甘露糖受体而定位于溶酶体，并以酶原形式存在，其前体没有活性，在受到刺激时可以被其他蛋白水解酶水解或者自身激活，其主要分布于溶酶体，也有极少部分定位于细胞核。在一定条件下会从溶酶体释放到胞质，也会释放到细胞外。有研究表明，在阿尔茨海默病(AD)患者的老年斑中，cathepsin L细胞外水平明显升高〔1，2〕，溶酶体和细胞膜的不完整导致cathepsin L的异常定位在老龄相关疾病和AD的发病中起重要作用。cathepsin L在AD中的表达国内尚无报道。本研究通过建立β-淀粉样蛋白(Aβ)大鼠海马注射制作AD动物模型，观察cathepsin L在AD大鼠脑组织中的表达，探讨其在AD中的意义。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性Wistar大鼠，体重(230±20)g，由浙江省医学科学院实验动物中心提供。用Y-迷宫测试判定其空间辨别性学习记忆能力，淘汰反应过于迟钝或特别敏感的大鼠，将选出的大鼠随机分为正常组、假手术组和模型组，每组8只。

1.2 试剂和仪器 Aβ25～35(Sigma公司)、cathepsin L鼠抗单克隆抗体(Bio-Rad公司)、羊抗鼠标记的异硫氰酸荧光素(FITC)(北京中山生物技术公司)、Morris水迷宫(中国医学科学院产品)、脑立体定位仪(NAR ISA IGE SN-2)。

1.3 模型制备 模型组大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.35 g/kg麻醉，头部固定在脑立体定位仪上，剪毛消毒，在头背中部纵向切口，暴露颅骨，定位坐标:双侧海马区注射点(AP－3.5 mm，ML±2.0 mm，DV 2.7 mm)用微量进样器(上海高欣玻璃仪器厂产品)注射 5 μl(10 μg)Aβ25～35(聚集态的 Aβ25～35形成)，10 min内注完。假手术组注射等量的生理盐水。庆大霉素消毒，缝合皮肤。1 w后进行行为学检测。假手术组除不注射 Aβ25～35外，其余步骤同模型组;正常组大鼠不做任何处理。

1.4 行为学检测 模型制备7 d后，用Y-迷宫进行行为记忆观察。对各组大鼠进行学习获得能力次数测试和记忆再现次数测试。

1.5 标本的收集 行为测试后，大鼠用10%水合氯醛(0.35 g/kg)麻醉，并用4%多聚甲醛和0.1 mol/L磷酸缓冲液进行心脏灌流，之后取出大脑放入大鼠脑模具中进行冠状切开，取各组相同断面进行连续切片并进行免疫荧光染色。

1.6 HE染色 切片置于室温下干燥30 min后，分别放入苏木素和伊红染液中进行染色。

1.7 cathepsin L免疫荧光染色 将脑片用振动切片机切成30 μm厚的切片，之后根据免疫荧光染色操作说明书进行染色。各组实验均以不加第一抗体作阴性空白对照。cathepsin L阳性物质呈红色荧光。

1.8 cathepsin L表达的检测 随机抽取各组大鼠5只麻醉后快速断头，在冰上取新鲜海马组织，剪碎后加1∶10裂解液，匀浆，17 000 r/min 4℃离心1 h，取上清液用考马思亮蓝G250结合法测蛋白含量，根据已知牛血清白蛋白溶液的浓度及其吸光度和样品吸光度计算样品蛋白浓度。SDS-PAGE电泳:凝胶浓度为7.5%，电转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉TTBS缓冲液震荡封闭3 h，将膜移入杂交袋中，加入用封闭液稀释的1∶300 一抗 4℃ 过夜，β-actin(1∶300 购于 Santa Cruz公司)，洗膜。加入用封闭液稀释的1∶500二抗(羊抗鼠IgG购于Santa Cruz公司)，室温反应1 h，洗膜。洗膜后进行ECL(购于Santa Cruz公司)反应1～3 min。在暗室内曝光显影后冲洗胶片，凝胶成像分析系统摄影分析。

1.9 图像分析及统计学处理 将荧光显微镜下所摄cathepsin L阳性神经元照片用计算机图像分析系统(HM IAS)记录阳性细胞数和总细胞数，并记录阳性细胞百分率;Western印迹检测蛋白带应用Metamorph图像分析系统和Bio 2RAD Gel2000光密度扫描仪进行光密度扫描测定，计算整合光密度值(IDV)，计算出各组样品目标带与β-actin IDV比值。实验数据用±s表示，采用SPSS12.0统计分析软件进行单因素方差分析，显著性检验用t检验。

2 结果

2.1 行为学改变 见表1。模型组大鼠的学习所需次数和记忆再现所需次数均长于正常组(P＜0.01)，而假手术组与正常组在学习所需次数和记忆再现所需次数上无明显差异，说明Aβ25～35对学习记忆的获得和记忆再现均有影响。

2.2 HE染色 AD组大鼠海马注射针道附近可见细胞增生、聚集，核小深染，成扁圆形，判断为胶质细胞。CA1区锥体细胞数量较对照组明显减少，可见大量肿胀及圆齿形神经元，核边聚、碎裂，成凋亡趋势，局部神经元大段缺失，胶质细胞增生(图1)。假手术组海马神经元轻度受损(图1)，与AD组比较有显著差异。

表1 两组行为学测试(n=8，±s)

表1 两组行为学测试(n=8，±s)

与正常组比较:1)P＜0.01

组别 学习获得能力次数 记忆再现次数正常组9.3 ±2.46 4.2 ±0.4模型组 26.7±5.11) 21.1 ±3.11)假手术组12.8±2.2 5.8 ±0.3

图1 两组大鼠海马神经元(HE，×400)

2.3 cathepsin L蛋白荧光检测 见表2、图2。cathepsin L蛋白荧光检测结果显示，模型组大鼠在cathepsin L阳性神经元数量和阳性细胞百分率上均高于正常组大鼠(P＜0.05)。

表2 cathepsin L阳性神经元的表达(n=8，±s)

表2 cathepsin L阳性神经元的表达(n=8，±s)

与正常组比较:1)P＜0.05

组别 神经元数量 百分率(%)正常组7.4 ±2.1 15.9±1.17模型组 31.5±4.81) 34.6±0.951)假手术组9.6±5.3 16.9±0.64

图2 大鼠海马神经元cathepsin L蛋白表达(FITC，×400)

2.4 cathepsin L蛋白Western印迹检测 见图3。cathepsin L蛋白印记分析显示，模型组大鼠的cathepsin L蛋白印记条带DV值高于正常组〔(0.35±0.46)vs(0.14±0.02)，P＜0.01〕，而假手术组与正常组大鼠的cathepsin L蛋白印记条带IDV值无明显差异〔(0.14±0.02)，P＞0.05〕。

图3 Cathepsin L蛋白Western印迹结果

3 讨论

AD的病理特征是脑内神经元出现大量的老年斑(SP)。本研究采用Aβ25～35海马内 CA1区注射造成Aβ沉积的AD模型，模型组大鼠的学习所需次数和记忆再现所需次数均长于正常组，模型组大鼠可见大鼠海马注射针道附近可见细胞增生、聚集，核小深染，成扁圆形，判断为胶质细胞。CA1区锥体细胞数量较对照组明显减少，可见大量肿胀及圆齿形神经元，核边聚、碎裂，成凋亡趋势，局部神经元大段缺失，胶质细胞增生，在行为学和病理改变上证明模型是成功的。

cathepsin L的主要功能是降解和更新细胞内的蛋白，它在溶酶体降解蛋白的过程中发挥着重要作用，使细胞内的蛋白保持动态平衡，从而参与了机体很多正常的生理活动。研究证明其在神经递质的加工处理〔3，4〕，抗原呈递〔5〕、组织器官的发育等方面起着重要作用。近来研究证明，cathepsin L与神经退行性疾病，如AD密切相关。本研究发现AD大鼠海马区cathepsin L阳性神经元数量明显增加，提示cathepsin L的表达水平升高与海马神经元退行性变有关。已经有研究证明cathepsin L参与了caspase-3的激活〔6〕，并对神经元的凋亡具有调节作用，但是参与的详细机制仍不明确。

cathepsin L参与海马神经元死亡的可能机制是，cathepsin L参与了小胶质细胞激活所诱发的炎症反应，炎症反应在神经退行性疾病中作用一直受到重视。研究已证实用刺激小胶质细胞，cathepsin L表达升高，且参与了小胶质细胞介导的神经元的死亡过程〔2〕。可见，溶酶体蛋白酶cathepsin L的表达、分部及活性的改变既可以在神经元内参与凋亡，还可以在小胶质细胞的激活过程中发挥作用，其在AD中的具体作用及机制还有待于进一步探讨。

1 Nakanishi H.Neuronal and microglial cathepsins in aging and age related diseases〔J〕.Ageing Res Rev，2003;2(4):367-81.

2 Gan L，Ye S，Chu A，et al.Identification of cathepsin B as a mediator of neuronal death induced by A beta-activated microglial cells using a functional genomic approach〔J〕.J Biol Chem，2004;279(7):5565-72.

3 Hook VY.Unique neuronal functions of cathepsin L and cathepsin B in secretory vesicles:biosynthesis of peptides in neurotransmission and neurodegenerative disease〔J〕.Biol Chem，2006;387(10-11):1429-39.

4 Funkelstein L，Toneff T，Hwang SR，et al.Cathepsin L participates in the production of neuropeptide Y in secretory vesicles，demonstrated bu protease gene knockout and expression〔J〕.J Neurochem，2008;106(1):384-91.

5 Hsing LC，Rudensky AY.The lysosomal cysteine proteases in MHC class II antigen presentation〔J〕.Immunol Rev，2005;207:229-41.

6 Ishisaka R，Utsumi T，Kanno T，et al.Participation of a cathepsin L-type protease in the activation of caspase-3〔J〕.Cell Struct Funct，1999;24(6):465-70.