丹皮酚抑制心肌梗死家兔心肌TLR4信号通路改善心室重构

周晓慧 任立群 刘维朝 陈亚娟 董世超 张 楠 王 乾

(承德医学院生物化学教研室，河北 承德 067000)

动物实验表明，缺乏TLR4受体的小鼠心肌在缺血1 h后复灌24 h较保留TLR4受体的小鼠心肌有较小的心梗面积和较少的炎性细胞浸润〔1〕。研究表明，丹皮酚具有抗炎、抗氧化、抗血栓、抗AS、抗肿瘤等广泛的药理作用〔2〕。丹皮酚是否能通过影响心肌梗死(MI)的心肌组织中TLR4及其下游炎症因子肿瘤坏死因了(TNF)-α等的表达而发挥改善心室重构的作用尚不明确，本实验拟通过研究丹皮酚对MI兔心肌TLR4及其下游炎症因子TNF-α表达的影响及其与心室重构的关系，为丹皮酚抗MI后心室重构的研究提供有价值的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 健康家兔40只(体质量1.5～2.0 kg，购自承德医学院实验动物中心)。

1.2 药品与试剂 丹皮酚购自安徽宣城百草植物工贸有限公司，纯度99%，Trizol，美国Invitrogen公司;TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒，大连宝生物工程有限公司;TLR4、TNF-α、β-actin引物，上海生物工程有限公司。

1.3 仪器 DB-3型心电图机，上海光电医用电子仪器有限公司，BL-420生物机能实验系统。

1.4 方法

1.4.1 兔MI模型建立与分组 将健康家兔用30 g/L戊巴比妥钠 (30～50 mg/kg)，耳缘静脉麻醉，胸骨正中切开，剪开心包，仔细辨认冠状动脉左室支并结扎其中段，(假手术组只开胸，剪破心包，在相应部位挂线不结扎)。以心电图ST段抬高，局部心肌颜色变苍白、节段性运动不良为判断冠状结扎成功(即模型成功)的标志。术后24 h将存活兔分为4组：MI组(n=8)、假手术组(n=8)、MI+丹皮酚低剂量组(75 mg·kg－1·d－1，n=9)、MI+ 丹皮酚高剂量组(150 mg·kg－1·d－1，n=8)灌胃，连续4 w，MI组、假手术组每日以等量生理盐水灌胃。

1.4.2 血流动力学测定及标本采集 4 w后称取家兔体重(BW)，麻醉同前。右颈总动脉插入直径1 mm聚乙烯塑料管逆行进入左心室，利用BL-420E生物机能实验系统。分别记录左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室压力最大上升和下降速率(±LV dp/dtmax)，记录完毕后，导管内注入10%氯化钾3～5 ml处死兔，迅速开胸取出心脏，冰生理盐水中洗尽血液，剪除左、右心耳及残余大血管后，以滤纸拭干，然后分别称取右室重量(RVW)及左室重量(LVW)，分别计算与体重比值(即相对重量)。随后将左心室自结扎线垂直于心脏长轴分为心尖部(梗死区为主)与心底部(非梗死区)切成100 mg左右小块，无菌锡纸包裹液氮速冻24 h，－80℃冰箱冻存。

1.4.3 RT-PCR法检测TLR4和TNF-α mRNA的表达 分别取各组心肌组织100 mg剪碎，用Trizol抽提组织总RNA，紫外检测样品吸光度值A，A260/A280为1.8～2.0。应用RT-PCR法检测TLR4、TNF-α mRNA的表达。PCR中 TLR4的引物序列：上游引物：5 TGGGCTTAGAACAACTGGAAC 3下游引物：5 CAGAACCTGGAGGGAGTAGAG 3，扩增片段：392 bp;TNF-α 的引物序列：上游引物：5 GTAGTAGCAAACCCGCAAGTG 3，下游引物：5 TGGGAGTAGATGAGGTACAGCC 3，扩增片段：137 bp;β-actin：上游引物：5 CGTGCTGTCCCTGTACGCCTCT 3，下游引物：5 CGCTCGTTGCCGATGGTGAT 3，扩增片段：348 bp，反应条件：预变性 94℃，2 min，变性：94℃，30 s，退火：.TLR4 52℃，TNF-α 58℃，β-actin 62℃，延伸：72℃ 1 min，30 个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物5 μl于2%的琼脂糖凝胶上电泳，160 V电压，电泳2 h，紫外透射仪观察并摄取图像。应用Quantity One软件进行定量分析，以目的基因条带的光密度与β-actin基因条带光密度的比值，作为各目的基因mRNA表达的相对水平。

2 结果

2.1 血流动力学变化 术后4 w后，与假手术组比较MI组LVEDP显著增加(P＜0.01);±LV dp/dtmax显著降低(P＜0.01)，与MI组比较，丹皮酚低、高剂量组LVEDP显著降低(P＜0.01)，±LV dp/dtmax明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 各组血流动力学参数变化(s)

表1 各组血流动力学参数变化(s)

与假手术组比较：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;与 MI组比较：3)P ＜0.05，4)P ＜0.01;下表同

组别 n LVSP(mmHg)LVEDP(mmHg)+dp/dtmax(mmHg/ms)－dp/dtmax(mmHg/ms)138±15 2.10±0.95 5.55±0.45 4.10±0.55 MI组 8 117±111) 14.80±3.302) 3.56±0.382) 2.39±0.362)MI+丹皮酚低剂量组 9 128±133) 10.00±1.804) 4.88±0.563) 3.58±0.343)MI+丹皮酚高剂量组 8 132±164) 9.10±2.104) 4.96±0.353) 3.94±0.563)假手术组8

2.2 左、右心室相对质量 术后4 w后，与假手术组比较，MI组左、右心室相对质量显著增加(P＜0.01)，与MI组比较，丹皮酚低、高剂量组左、右心室相对质量显著降低(P＜0.05)。见表2。

图1 各组兔心肌组织TLR4、TNF-α mRNA的表达

2.3 TLR4、TNF-α mRNA表达的变化 术后4 w，与假手术组比较，MI组 TLR4、TNF-α mRNA 表达明显提高(P ＜0.01)，与MI组比较，丹皮酚低TLR4、高剂量组TNF-α mRNA表达明显降低(P ＜0.01，P ＜0.05)。见表3、图1。

表2 各组心室重量/体质量变化(s)

表2 各组心室重量/体质量变化(s)

组别 n LVW/BW(g/kg)RVW/BW(g/kg)8 1.51±0.09 0.59±0.03 MI组 8 1.75±0.252) 0.80±0.071)MI+丹皮酚低剂量组 9 1.66±0.163) 0.70±0.123)MI+丹皮酚高剂量组 8 1.65±0.133) 0.68±0.113)假手术组

表3 各组心肌组织TLR4、TNF-α mRNA表达变化( s，n=4)

表3 各组心肌组织TLR4、TNF-α mRNA表达变化( s，n=4)

0.904 2±0.013 0.017 2±0.000 62 MI组 1.206 7±0.0251) 0.0271±0.000 161)MI+丹皮酚低剂量组 1.096 7±0.0232) 0.023 0±0.000 132)MI+丹皮酚高剂量组 0.990 0±0.0203) 0.019 4±0.000 202)-actin假手术组组别 TLR4/β-actin TNF-α/β

3 讨论

自身免疫炎症反应在MI后心室重构过程中发挥重要作用，TLR4是天然免疫系统的一种模式识别受体，是哺乳动物将细胞外抗原识别信息向细胞内传递并引发炎症反应的关键跨膜蛋白，为机体炎性反应链的启动蛋白，其外源配体与内源性配体等均可激活TLR4，通过信号级联反应最终引起NF-κB的激活，上调TNF-α、IL-6等众多的炎性因子表达〔3〕。另有研究表明高血压大鼠心肌组织中TLR4和NF-κB的表达水平升高，两者高度正相关;TLR4的表达水平与左室心肌纤维化呈正相关〔4〕，与左室心肌肥厚程度收缩功能指数显著相关〔5〕。因此TLR4信号通路的活化介导免疫炎症反应，可能参与心室肥厚的发生发展。TLR4基因缺陷的大鼠，实验性心梗模型较野生性大鼠存活率明显升高，心室重构明显减轻〔6〕。本研究结果表明TLR4信号通路在MI心室重构中的作用，丹皮酚改善MI兔心室重构作用可能与其抑制MI心肌TLR4及下游炎症因子TNF-α的表达有关，但有关丹皮酚抑制MI心肌TLR4表达的分子机制尚不明确，需进一步深入研究。

1 Oyama J，Blais C，Liu XL，et al.Reduced myocardial ischemia reperfusion injury in toll2like receptor 42 deficient mice〔J〕.Circulation，2004;109(6)：784-9.

2 李 骅，王四旺，张邦乐.丹皮酚的药理活性和药物动力学研究进展〔J〕. 亚太传统医药，2010;6(2)：110-2.

3 Michelsen KS，Arditi M.Toll-like receptor signaling and at hero-sclerosis〔J〕.Curr Opin Hematol，2006;13(1)：163-8.

4 和亚萍，曲 鹏，李桂华.TOLL样受体在Goldblatt鼠左室心肌中的表达炎症与左室心室肥厚相关的一个证据〔J〕.高血压杂志，2005;13(8)：483-7.

5 Shishido T，Nozaki N，Yamaguchi S，et al.Toll like receptor-2 modulates ventricular remodeling after myocardial infarction〔J〕.Circulation，2003;108(23)：2905-10.

6 Riad A，Jager S，Sobirey M，et al.Toll like receptor-4 modulates survival by induction of left ventricular remodeling after myocardial infarction in mice〔J〕.Immunol，2008;180(10)：6954-61.