黄连解毒汤对代谢综合征大鼠心肌的保护作用及对胰岛素信号转导的影响

李晓星 包成梅 李传保 季晓平 (山东大学齐鲁医院干部保健科，山东 济南 500)

代谢综合征(MS)是以糖代谢异常、高血压、血脂紊乱、中心型肥胖等多种代谢紊乱或危险因素聚集一体的临床症候群，胰岛素抵抗在MS的发病机制中处于中心地位。黄连解毒汤是清热解毒经典方剂，由黄连、黄岑、黄柏、桅子四味生药组成。系统研究表明，黄连解毒汤具有降糖、调脂、抗炎、改善胰岛素抵抗等作用〔1，2〕。本研究以高糖、高脂结合高盐饮食建立MS大鼠模型，旨在观察MS大鼠肌损伤的特点，评价黄连解毒汤对核因子-κB(NF-κB)表达及胰岛素受体底物1(IRS-1)丝氨酸磷酸化水平的影响，从而为阐明黄连解毒汤保护MS大鼠心肌的机制，提供重要的理论依据。

1 资料与方法

1.1 药物与试剂 黄连解毒汤由黄连、黄芩、黄柏、栀子按3∶2∶2∶2比例组成，其药材均购于济南建联中药，煎煮取汁，浓缩成清膏。取清膏送山东大学齐鲁医院药剂科以薄层扫描方法测得其所含盐酸小檗碱为18 mg/g;黄连解毒汤清膏临用前以PBS溶液(pH 7.4)配成含盐酸小檗碱37.4 g/L的混悬液;胰岛素放射免疫分析试剂盒购自天津九鼎医学生物工程有限公司;血糖、甘油三酯(TG)酶免试剂盒购自罗氏公司。一抗为美国Cell signal公司产品，二抗购于北京中杉生物技术有限公司。

1.2 动物及分组 雄性6周龄Wistar大鼠65只，均购自山东大学实验动物中心，随机分为两组:正常对照组(NC组，n=10)，模型组(n=55)。NC组给予标准大鼠饲料及普通饮水喂养，模型组给予高糖、高脂及高盐饲料及20%高蔗糖水喂养(HF饮食)。HF饮食喂养16 w后，将成模的其中21只大鼠随机分为MS组(n=10)和黄连解毒汤组(MS+H组，n=11)。此后12 w，MS+H组继续给予HF饮食同时每天以黄连解毒汤0.5 ml/100 g灌胃;MS组继续给予HF饮食同时每天以等量生理盐水灌胃;NC组继续给予标准大鼠饲料及普通饮水喂养同时每天以等量生理盐水灌胃。

1.3 生化指标的检测 整个实验过程中，每2周称量体重(BW)及测尾动脉收缩期血压(SBP)1次;分别于造模前、HF饮食喂养16 w、实验末抽取静脉血测定空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、总胆固醇(TC)、TG。血清胰岛素用放免法测定，严格按试剂盒说明书进行。

1.4 组织学观察 实验结束时处死动物，留取心脏标本，以10%中性甲醛溶液固定24 h，取固定后心肌组织，梯度酒精系列脱水，常规石蜡包埋切片，行天狼猩红染色。光镜下观察胶原纤维，拍片，扫描。

1.5 透射电镜观察 留取心脏标本，用4℃预冷的2%戊二醛固定液固定，再以锇酸后固定，取固定后心肌组织经脱水、浸透、包埋后制备超薄切片，在透射电镜下，观察心肌组织超微结构的变化，选取典型视野拍照。

1.6 Western印迹法检测各蛋白的表达 每20 mg心肌组织置于培养皿中，手术剪剪碎成细小碎片(冰上进行);组织中加入细胞裂解液，混匀。每20 mg组织加入200 μl裂解液，1 μl PMSF;将组织充分匀浆裂解，冰浴 20 min;离心10 000～14 000 r/min，4℃离心5 min;取上清转移至新的预冷的离心管中，即为全蛋白提取物，蛋白定量;分装保存于－70℃，避免反复冻融。配胶，将蛋白质Marker与待测样品一次上样，行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳;待染料到达分离胶底部，断开电源，行蛋白质的电转移，200 mA恒流转移3 h。取出电转移完毕的硝纤膜至10 ml 5%脱脂奶粉封闭液中，室温下摇床摇2 h。用抗体稀释液分别稀释 β-actin抗体(1∶1 000)，NF-κB P65抗体(1∶500)，磷酸化 IRS-1(Ser307)抗体(1∶1 000)，磷酸化 Akt抗体(1∶1 000);将硝纤膜浸入一抗溶液的培养皿中，室温震荡2 h(或4℃反应过夜)。根据一抗选用合适的二抗，用5%脱脂奶粉封闭液分别配制二抗反应液(1∶3 000～1∶20 000)。二抗反应过后，取出膜于1×TBST溶液中漂洗，10 min×3次。

将上述反应过后的硝纤膜进行放射自显影处理。应用生物凝胶电泳图像分析系统(AlphaImager 2200)扫描定量，计算各组目的蛋白相对于β-actin的相对光密度值作为各蛋白的相对含量。

2 结果

2.1 各组大鼠体重、血压比较 见表1、图1。各组大鼠在基础状态时BW、SBP无明显差异，但在HF饮食喂养16 w后，MS组大鼠BW、SBP明显高于NC组，用药物干预12 w后，MS+H组BW及SBP明显低于MS组(P＜0.05，P＜0.01)。

表1 实验末各组大鼠体重、血压及生化指标比较(±s)

表1 实验末各组大鼠体重、血压及生化指标比较(±s)

与NC组比较:1)P＜0.01;与MS组比较:2)P＜0.05，3)P＜0.01

组别 BW(g) SBP(mmol/L) FBG(mmol/L) FINS(μIU/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L)NC组(n=10) 567.50±28.28 102.35±4.38 5.48±0.48 17.68±5.21 0.73±0.26 1.60±0.17 MS组(n=10) 661.78±26.711) 139.80±6.921) 8.51±0.991) 35.85±10.451) 0.91±0.26 2.04±0.151)MS+H组(n=11) 552.35±34.563) 128.00±7.313) 6.53±0.983) 23.86±8.512) 0.75±0.30 1.90±0.302)

图1 MS大鼠与NC大鼠不同周龄体重、血压比较

2.2 生化指标比较 见表1。药物干预前，与NC组比较，MS组及MS+H组大鼠FBG、FINS及TC升高(P＜0.01);药物干预12 w后，与MS组比较，MS+H组FBG、FINS明显下降(P＜0.05);MS+H组TC水平明显下降(P＜0.05)。

2.3 天狼猩红染色结果 见图2。偏振光镜下可见胶原纤维呈红色，与NC组相比，MS组心肌间质胶原纤维明显增多;MS+H组较MS组心肌间质胶原纤维明显减少。

2.4 透射电镜观察结果 见图3。NC组左室心肌组织细胞排列整齐;粗细肌丝排列整齐，肌小节及明暗各带清晰可见;线粒体丰富、大小均一、圆形或椭圆形;MS组左室心肌组织细胞部分肌节宽窄不一，肌丝排列紊乱;线粒体明显增多，肿胀，可见指纹状线粒体(箭头所示);MS+H组大鼠左室心肌组织总体较MS组明显好转，细胞排列较整齐;线粒体大小较一致，排列较规整，未见指纹状线粒体。

图2 各组大鼠心肌组织天狼猩红染色(×400)

图3 各组大鼠心肌组织透射电镜结果(×1 000)

2.5 Western印迹检测结果 见图4。与NC组比较，MS组蛋白NF-κB含量明显升高(P＜0.05);丝氨酸磷酸化IRS-1(PIRS-1)水平明显升高(P＜0.01);磷酸化Akt(P-Akt)水平明显降低(P＜0.01);与MS组比较MS+H组蛋白NF-κB表达明显降低(P＜0.01);MS+H组P-IRS-1表达明显降低(P＜0.05);MS+H组P-Akt表达明显升高(P＜0.01)。

图4 各组大鼠心肌组织NF-κB、P-IRS-1及P-Akt蛋白水平比较

3 讨论

黄连解毒汤出自唐·王焘所著《外台秘要》，由黄连、黄芩、黄柏、栀子4味中药按3∶2∶2∶3比例配伍组成，其中以黄连泻心火、兼泻中焦之火为君;黄芩清肺热、泻上焦之火为臣;黄柏泻下焦之火，栀子通泻三焦之火，导热下行，合为佐使，共以收泻火解毒之功，无论内服、外服，均有良好的治疗作用〔3〕。方素萍等〔4〕研究表明，黄连解毒汤含药血清不仅能抑制非致炎状态下中性粒细胞与血管内皮细胞的黏附，而且能抑制致炎因子所诱导的中性粒细胞与血管内皮细胞黏附作用增强，这可能是其抗炎作用机制之一。同样有研究表明黄连解毒汤能够抑制动脉粥样硬化斑块的发展〔5〕。动物实验证明，黄连解毒汤中的重要成分小檗碱能改善心肌肥厚大鼠异常的心功能，抑制心肌细胞增生，阻止压力负荷过重而引起的心肌肥厚的发展〔6，7〕。本研究进一步证明黄连解毒汤对MS大鼠心肌的保护作用及其改善胰岛素抵抗的机制。

MS所有组成成分都是心血管疾病的独立危险因素，这些与代谢有关的多种疾病或致病因素同时出现在一个个体身上，其临床预后不良的危险大于仅有一种危险因素患者，而且其效应不是简单相加，而是协同加剧，严重危害人类健康〔8〕。糖脂代谢紊乱是导致心脏结构和功能改变的重要原因。而改善IRS/PI3K/Akt通路进而改善糖脂代谢，具有重要的保护心脏结构和功能的作用。本结果提示HF饮食喂养28 w MS大鼠出现明显的心肌损伤结构改变。黄连解毒汤对MS大鼠心肌起到明显的保护作用。

IR是MS发病的中心环节之一，生理情况下，胰岛素转导信号通路为:胰岛素与胰岛素受体结合-胰岛素受体磷酸化-胰岛素受体底物(IRS)酪氨酸磷酸化-激活其下游底物-胰岛素信号转导至效应器。MS是一种全身慢性系统性的低度炎症状态，炎症反应在MS发生发展中起重要作用，炎症是引起胰岛素抵抗的病理生理基础〔9〕。胰岛素受体后的信号通路与炎症因子的信号传导存在交叉作用，导致IR的主要分子机制是非特异性炎症所产生的炎症因子干扰胰岛素受体底物/磷脂酰肌醇-3-激酶(IRS/PI3K)信号转导通路〔10〕。体外实验已发现至少有8种激酶使IRS的丝氨酸磷酸化，炎性因子TNF-α、IL-6等均可激活这些激酶。干扰胰岛素信号转导的激酶包括c-jun氨基末端激酶、核因子-κB(NF-κB)抑制物激酶(IKK)、蛋白激酶 C和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白等〔11，12〕。目前研究较多的是导致胰岛素抵抗的三条途径，即IKK/NF-κB、JNK、SOCS-3。本研究结果显示，MS组大鼠心肌组织中NF-κB蛋白表达增多，间接证实炎症在MS大鼠心肌中的启动;MS大鼠心肌组织中存在炎症的激活，使得IRS307位点的丝氨酸磷酸化增强，阻碍IRS正常的酪氨酸磷酸化，进而影响胰岛素信号传导通路。给予黄连解毒汤后，炎症激活受抑制，胰岛素信号传导通路正常发挥作用，进而起到保护心肌结构和功能的作用。

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