老年性白内障晶状体上皮细胞凋亡及caspase-3表达

何小杰 李延辉 徐 飞 袁煜宗 (东莞市石碣医院眼科，广东 东莞 523290)

老年性白内障的发病率不断上升，已成为目前世界上第一位致盲眼病〔1〕。虽然手术一直是治愈老年性白内障，让患者重见光明的主要手段，但手术毕竟用人工材料置换替代本身晶体的组织器官，从某种意义上是有所缺陷的;同时其手术风险及昂贵的手术设备、耗材等经济原因也让许多较贫困老年性白内障患者望而却步。因此，深入研究白内障发病机制，通过预防白内障发生或延缓其发展的途径来征服老年性白内障已成为一项十分有益的课题。研究表明，细胞凋亡在白内障的发病中起着重要的作用，且晶状体上皮细胞(LECs)的凋亡是除先天性白内障以外的所有类型白内障形成的细胞学基础〔2〕。caspase-3是近年来发现执行哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶，一些研究资料显示，caspase-3可能参与了LECs的凋亡和白内障的形成〔3，4〕。本研究通过研究老年性白内障患者及正常人LECs的凋亡情况及相关调控基因caspase-3的表达，进一步阐明LECs凋亡在老年性白内障患者发生过程中的分子生物学机制，为白内障的治疗以及药物的开发提供新的思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2007年9月至2012年2月我院眼科收治的老年性白内障患者25例为研究组，其中男13例(13眼)，女12例(12眼)，年龄50～79岁，平均年龄(62.4±4.6)岁。所有病例均在常规白内障显微手术术中采用连续环形撕囊，获取其中央部的晶状体前囊膜(直径约5 mm)。另收集无白内障发生的成年人尸体解剖眼球的晶状体前囊膜标本10例(标本来自暨南大学附属第一医院)为对照组。两组取材标本均置入10%中性缓冲甲醛溶液中固定24～48 h，常规石蜡包埋，连续切片，厚度约 3 μm。

1.2 主要试剂 EnVision试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，caspase-3山羊抗人多克隆抗体(工作浓度1∶50)均购自美国PTG公司。TUNEL检测细胞凋亡试剂盒购自Roche公司。

1.3 TUNEL方法检测LECs的凋亡 切片常规脱蜡、水化、3%H2O2灭活处理、蛋白酶K消化，PBS液洗涤3次后加入TUNEL反应液(含TdT和Bio-21-dUTP)，置37℃水浴箱1 h;终止后加入SAAP反应液，置37℃水浴箱30 min;用DAB显色，苏木素衬染，脱水，透明，封片，光镜下观察。用无DNA末端转移酶的标记液代替TUNEL反应液设为阴性对照。结果判定:细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞，而正常细胞核被染为蓝色。每张切片随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞，计算凋亡细胞百分率:凋亡细胞与总细胞的比值即为上皮细胞凋亡率。

1.4 免疫组织化学染色 采用免疫组化Envision法检测两组LECs中caspase-3的表达。操作程序:切片常规脱蜡和水化后，置于3%H2O2灭活内源性过氧化氢酶，微波加热修复抗原，10%正常血清封闭，滴加一抗(caspase-3)，4℃冰箱孵育过夜，滴加二抗-HRP多聚体，室温孵育30 min，DAB显色，苏木素衬染，脱水，透明，封片，光镜下观察。PBS代替一抗为阴性对照，试剂盒提供的样本片为阳性对照。染色结果判断:LECs内见黄色或棕色颗粒为染色阳性。每张切片随机选择检查5个视野，计数100个细胞，计数阳性细胞数，计算阳性细胞率。0%～5%为(－);5% ～10%为(+);20% ～35%为();35% ～50%为()。(+)～()记为阳性。

1.5 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行χ2检验法和等级相关检验。

2 结果

2.1 两组LECs的凋亡情况比较 研究组LECs中可见胞核呈棕黄色颗粒的凋亡细胞，凋亡细胞百分率为(30.4±3.7)%。对照组LECs中偶见凋亡细胞，凋亡细胞百分率为(0.27±0.12)%，研究组显著高于对照组(t=11.59，P＜0.01)。

2.2 两组LECs中caspase-3蛋白的表达比较 研究组LECs中caspase-3蛋白的阳性表达率显著高于对照组(t=12.05，P＜0.01)，表1。

表1 两组LECs中caspase-3蛋白的表达比较

2.3 caspase-3表达与细胞凋亡数之间的关系 25例老年性白内障患者的LECs中caspase-3蛋白的表达与细胞凋亡数间呈正相关(r=0.621，P ＜0.01)。

3 讨论

晶状体的发展依赖LECs不断增殖和分化，LECs作为晶状体中唯一有分裂活性的细胞，对晶状体纤维生长和生长质量、维持晶状体内环境的稳定、保持晶状体纤维渗透压的稳定起着重要的作用。目前研究认为白内障的发生与LECs的凋亡有直接关系，凋亡可导致LECs的结构和功能受损，并随之发生细胞骨架和晶状体蛋白变性、大分子聚集等一系列生化改变，形成白内障〔5，6〕。但近年来的研究对老年白内障LECs是否存在细胞凋亡一直未有定论，对其具体分子生物学机制也尚不清楚。

Li等〔7〕用透射电镜观察正常及白内障患者晶状体上皮细胞超微结构时发现:正常LECs形态规则，一般无凋亡发生，而白内障患者LECs中可见凋亡细胞。TUNEL法是经过不断改进而发展起来的一种有效检测细胞凋亡的技术，该方法有特异性，且在光镜下可辨认单个散在分布的凋亡细胞。本研究结果进一步验证了LECs凋亡与老年性白内障的发生密切相关。因此，综合利用基因工程，免疫组化，免疫印迹等先进研究技术深入研究影响LECs凋亡的相关调节基因的作用及其机制，就可能抓住老年性白内障发病机制的主要环节，为其防治提供新的思路。

caspase是一组半胱氨酸蛋白酶家族，是近年来细胞凋亡分子生物学研究的重要发现。caspase-3是该家族中执行哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶，细胞经氧化剂、紫外线等诱因刺激之后，caspase-3从线粒体释放并被激活，可使细胞质、细胞核及细胞骨架的重要蛋白质降解失活，从而发生细胞凋亡〔8〕。本研究结果与王凯军等〔9〕和郑广瑛等〔10〕研究结果相似，提示caspase-3可能在老年性白内障形成过程中起重要作用。推测可能与caspase-3蛋白能参与酶切多种底物有关，其中晶状体连接蛋白是其直接作用目标。LECs凋亡或其他损害，可使晶状体内外钙离子失衡，可激活caspase-3蛋白酶系统，从而致细胞骨架及晶体连接蛋白降解，最后导致晶状体蛋白聚集，伴随出现的水电平衡失调及其他一些病理改变，最终形成白内障。

综上所述，LECs凋亡及caspase-3表达在老年性白内障的形成过程中起重要作用，相信随着LECs凋亡及caspase-3表达调控机制逐渐被人们所认识，caspase-3上游基因和下游的作用底物及各种协作因子将被逐渐阐明，caspase-3表达抑制剂的研发，利用其减缓老年性白内障的形成及发展，可能会成为今后研究的新方向。

1 MeCayrty CA，Taylor HR.The genetics of cataract〔J〕.Invest Ophhtalmo Vis Sci，2001;42:1677-8.

2 李伟华，亢泽峰，李 凌，等.晶状体上皮细胞凋亡调控基因与白内障的研究〔J〕.国际眼科杂志，2010;10(1):88-9.

3 Tamada Y，Fukiage C，Nakamura Y，et al.Evidence for apoptosis in the selenite rat model of catarac〔tJ〕.Biochem Biophys Res Commun，2000;275:300.

4 孙 红，惠延年，王 琳，等.晶状体上皮细胞凋亡与白内障发生的分子生物学机制〔J〕.中国临床康复，2003;3(7):398-401.

5 黄秀榕，祁明信，汪朝阳，等.复方水蛭滴眼液抑制大鼠晶状体上皮细胞凋亡及其对Bcl-2和Bax基因的调控〔J〕.中西医结合学报，2007;5(6):681-5.

6 李桂荣，苏冠方，周鸿雁.老年白内障晶状体上皮细胞凋亡及凋亡基因的表达〔J〕.中国老年学杂志，2007;27(1):70-2.

7 Li WC，Kuszak JR，Dunn K，et al.Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals〔J〕.J Cell Biol，1995;130(4):169-81.

8 申存周.ATP、PARP、Caspase-3细胞凋亡和胀亡〔J〕.中国血液流变学，2009;19(1):150-2

9 王凯军，姚 克，徐 雯，等.半胱氨酸天冬氨酸酶在过氧化氢诱导大鼠晶状体上皮细胞凋亡中的表达〔J〕.眼科研究，2002;20(6):502-5.

10 郑广瑛，梁圆圆，王 倩.年龄相关性白内障晶状体上皮细胞的Smac、caspase-3表达及死亡方式〔J〕.眼科研究，2010;28(4):351-5.