葛根异黄酮对衰老模型大鼠学习记忆及海马CA1区长时程增强的影响

王爱梅 徐持华 (河南南阳医学高等专科学校，河南 南阳 473061)

近年来，国内外对葛根提取物——葛根异黄酮的药理作用进行了较多的研究，发现其具有治疗心血管疾病、抗癌作用，治疗骨质疏松、预防和治疗糖尿病等作用〔1～4〕。葛根异黄酮对衰老模型大鼠学习记忆及海马CA1区长时程增强(LTP)的影响少见报道，本实验欲探讨葛根异黄酮改善衰老模型大鼠学习记忆能力及对海马神经突触可塑性的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用健康雌性Wistar大鼠55只，3～4月龄，体重(180±20)g，由河南医学动物实验中心提供(许可证号:410117)。

1.2 实验药物试剂及仪器 D-半乳糖由上海试剂二厂提供，批号20050422，葛根异黄酮由南阳张仲景现代中药发展有限责任公司提供，批号20080722，20%乌拉坦由上海国药集团化学试剂有限公司提供，批号T20080319，大鼠跳台系中国医学科学院药物研究所研制，RM6240型生物信号采集系统由成都仪器厂研制。

1.3 动物分组及给药 Wistar大鼠随机分为生理盐水组，衰老模型组，药物低、中、高剂量组，每组11只。造模时，模型组、药物组每天颈背部皮下注射1%D-半乳糖100 mg/kg，生理盐水组每天颈背部皮下注射等量生理盐水，连续6 w。造模成功后，第2天开始灌胃给药，药物低、中、高剂量组每天分别给予40、80、160 mg/kg葛根异黄酮灌胃，模型组、生理盐水组每天给予80 mg/kg生理盐水灌胃，连续8 w。

1.4 大鼠学习记忆能力测定——Morris水迷宫实验 动物灌胃结束后，进行Morris水迷宫实验。其中定位航行实验用于测量大鼠对水迷宫学习和记忆的获取能力，记录逃避潜伏期(EL);空间探索实验用于测量大鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的保持能力，记录120 s内大鼠在平台象限的游泳距离占总距离的百分比。

1.5 电生理学检测

1.5.1 大鼠的固定和电极的定位 在行为学结束后，大鼠以20%乌拉坦(1.5 g/kg)腹腔麻醉后，用耳杆将大鼠头部水平固定于立体定位仪上，参照Paxinos和Watson《大鼠脑立体定位图谱》确定记录电极和刺激电极的准确位置，在立体定位仪的引导下缓慢将电极穿过大鼠皮层至海马，调整记录电极及刺激电极在海马植入的最佳深度，至记录到最大的群体峰电位(PS)为止。以上操作均在屏蔽笼内完成。实验结束后，对记录电极、刺激电极作定位检查，定位不准确者剔除。

1.5.2 PS记录和LTP诱导 海马CA1区LTP的诱导方法参照文献，首先记录单个刺激诱发的PS 30 min作为基值，然后给予波宽0.1 ms、频率100 Hz的矩形波进行高频刺激(HFS)诱发LTP，记录HFS后60 min内的 PS。

1.5.3 观测指标和测量方法 实验中以PS幅度相对值(%)为观测指标，并观察其增幅情况。具体测量方法是，以HFS前30 min的PS值的均数为基线值，即100%，实验中每个PS值与之相比即得各点的PS幅度相对值，PS平均幅值高于基线值至少20%以上并持续30 min以上者可视为产生了LTP，连续观察记录60 min。PS幅值和潜伏期计算方法参照文献〔7〕。

1.6 统计学方法 使用SPSS13.0软件包进行数据分析，数据用±s表示，两组间比较用t检验，多组间比较用方差分析。

2 结果

2.1 各组大鼠学习记忆能力比较 随着训练的进行，各实验组EL均不断缩短，与模型组相比，中、高剂量组EL明显缩短(P＜0.01);各实验组撤离平台后大鼠在原平台象限内游泳的距离占整个游泳距离的百分比显示:与模型组相比，中、高剂量组所占距离百分比明显增高(P＜0.01，P＜0.05)，这说明葛根异黄酮中、高剂量对大鼠空间方位记忆能力有一定的影响。而低剂量组虽然要高些，但差异无显著性(P＞0.05)，见表1。

2.2 电生理学检测结果 高频刺激后各组大鼠PS幅度较刺激前增加，表明各组大鼠海马都有LTP的形成，如表5，高频刺激后模型组PS幅度有一定程度的增强，但明显低于生理盐水组(P＜0.01);中、高剂量组高频刺激后PS幅度明显大于模型组(P＜0.01);低剂量组与模型组差异不明显(P＞0.05)。从高频刺激后PS幅度变化可看出，生理盐水组、中、高剂量组在所记录的60 min内变化不明显，模型组和低剂量组的PS幅度却随着时间逐渐衰减。模型组和低剂量组在60 min内PS幅度均低于生理盐水组、中、高剂量组(P＜0.01)。生理盐水组、中、高剂量组在所记录的60 min内变化不明显无显著性差异。

表1 各组大鼠学习记忆能力及高频刺激后PS增幅比较(±s)

表1 各组大鼠学习记忆能力及高频刺激后PS增幅比较(±s)

与模型组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01

组别 n EL(s) 所占距离百分比(%)PS增幅(%)生理盐水组 9 20.78±3.122) 44.54±2.292) 170.20±0.562)模型组 9 42.24±5.41 33.94±1.69 124.57±1.06低剂量组 9 25.50±3.661) 38.55±3.70 126.44±0.87中剂量组 10 23.80±1.492) 41.61±2.561) 163.49±0.762)高剂量组 10 21.82±2.742) 43.65±1.562) 166.92±0.742)

3 讨论

学习记忆的神经生物学基础是神经细胞之间的联系结构突触的可塑性变化，大脑边缘系统海马结构作为学习记忆的关键部位，是一个具有可塑性的脑区。LTP被认为是研究学习和记忆的神经元可塑性的最好的模型〔8〕。LTP一般是指在条件刺激(多为较高频率的强直刺激)后，相同的测试刺激所引起的诱发突触反应长时问(一般长于半小时)明显增大的现象。LTP的形成是突触前后机制共同作用的结果，与突触前神经递质释放、突触后相关受体的Ca2+通道、蛋白激酶、逆行信使、即早基因等关系密切。在大鼠海马，来自CA3区锥体细胞的Schaffer侧支与CA1区锥体细胞树突形成突触，刺激Schaffer侧支使CA1区锥体细胞任何树突层受刺激均可诱出LTP。常用群峰电位(PS)振幅增大或PS潜伏期减小来判定突触传递是否强化以及是否出现LTP。LTP反映了突触可塑性变化中的神经电生理活动方面的改变，并作为神经科学研究当中衡量突触可塑性的一个主要的电生理指标。本文中，造模后PS振幅减小而用药后，PS振幅增大说明葛根异黄酮对于突触的可塑性具有一定的促进作用，并有可能是其改善学习记忆功能又一重要机制。

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3 王庆端，江金花，孙文欣，等.葛根总黄酮对鼠肝微粒体中细胞色素P450含量的影响〔J〕.中国药理学通报，2000;16(3):354-5.

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6 Yang Y，Zheng X，Wang Y，et al.Stress enables synaptic depression in CA1 synapses by acute and chronic morphine:possible mechanisms for corticosterone on opiate addiction〔J〕.J Neurosci，2004;24:2412-20.

7 Ikngaya Y，Saim H，Abe K.Attenuated hippocampal long-term potentiation in basolateral amygdala-lesioned rats〔J〕.Brain Res，1994;656:157.

8 Gruart A，Munoz MD，Delgado-Garcia JM.Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice〔J〕.Neuroscience，2006;26(4):1077-87.