电针智三针对血管性痴呆大鼠学习记忆能力及β－淀粉样蛋白表达的影响

唐中生 陆 莹 宋 华 谢高宇 罗亚非 张作涛 (贵阳中医学院解剖学教研室，贵州 贵阳 550002)

血管性痴呆 (VD)是指由于脑血管疾病和心血管病变的原因，因缺血性组织缺氧和出血性脑损害所导致的认知丧失〔1〕，VD患者有明显的记忆、思维、计算、定向、判断等能力障碍，已成为威胁高龄人群生命的重要疾病之一。β-淀粉样蛋白 (Aβ)是淀粉蛋白前体的降解产物，是脑组织内老年斑形成的物质基础。Aβ并非Alzheimer病所特有，也可见于VD。临床研究表明〔2〕，Aβ在血管性痴呆的发病机制中可能起了一定的作用。有关电针治疗VD之后血浆Aβ变化及其机制的报道还未见到。本研究探讨电针治疗VD的可能机制，为电针治疗VD提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 健康SD大鼠60只，雌雄各半，体重280～300 g，清洁级，由贵州省实验动物研究中心提供，合格证号:SCXK(黔)2002-0001。

1.2 实验器材 电子天平 (苏州精密仪器厂);g6805-1a电针治疗仪 (上海华谊医用仪器厂);80-2离心沉淀器 (上海手术器械厂);Dig Behv Morris水迷宫视频分析系统 (上海吉量软件科技有限公司);掀针 (苏州医疗用品厂有限公司)等。

1.3 药品与试剂 硝普纳 (北京制药工业研究所实验药厂);Aβ试剂盒 (南京建成生物工程研究所)。尼莫地平 (正大青春宝药业有限公司，批号:0801002)

1.4 实验方法

1.4.1 VD大鼠动物模型的建立 将动物随机分为假手术组、模型组、电针组和尼莫地平组，采用改良的Pulsinelli四血管阻断法 (4-VO)建立VD大鼠模型〔3〕。采用10%的水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔麻醉，行背侧颈正中切口，用电凝针烧灼双侧第一颈椎翼小孔内的椎动脉，造成永久性闭塞。再行腹侧颈正中切口，分离双侧颈总动脉，穿线备用。24 h后用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉5 min，共夹闭3次，每次间隔1 h。假手术组处理步骤同上，但不进行椎动脉烧灼和颈总动脉夹闭。模型制作成功标准:大鼠在4条血管阻断后1～2 min内，翻正反射消失，虹膜变白及瞳孔散大。

1.4.2 治疗方法 术后第7天开始治疗，治疗均在每天上午9:00～11:00进行，每日1次，连续治疗20 d。

1.4.2.1 电针组 根据针灸学中“人身处处皆是穴”的理论，参考华兴邦《大鼠穴位图谱》，按照人体结构与大鼠结构的比例和人体穴位的定位，以百会穴为参照点，于大鼠百会穴正中前下方2 mm处取神庭，神庭穴两侧旁开0.5 mm处取本神，然后以28号1寸毫针于大鼠神庭、本神三穴捻入0.5寸，连接电针仪，施以连续波，频率150 Hz，20 min后出针。

1.4.2.2 尼莫地平组 尼莫地平配成0.18% (g/ml)浓度的溶液，1 ml/只灌胃。

1.4.2.3 假手术组、模型组 均给予蒸馏水1 ml/100 g灌胃。

1.4.3 Morris水迷宫学习记忆能力检测〔4〕各组大鼠于术后第28天开始水迷宫测试。第1～6天进行定向航行实验，每日将大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限的顺序从各入水点 (各象限水池壁中点)靠池壁放入水中，记录60 s内大鼠从水中爬上站台所需时间为逃避潜伏期;第7天行空间探索实验，将大鼠从第Ⅰ象限入水点放入水池，记录2 min内大鼠在第Ⅲ象限游泳时间和穿越站台次数。数据由电脑自动采集。

1.4.4 血浆采集及检测 Morris水迷宫检测之后，于腹股沟处切开皮肤，剪断股静脉采集血液，肝素抗凝，静置后离心分离血浆，进行Aβ含量检测。然后开颅取脑，保留含有海马和大脑皮质的组织后固定12 h。经梯度酒精脱水、透明、浸蜡、包埋后，连续冠状切片，苏木素-伊红 (HE)染色，光镜观察海马和大脑皮质神经元的病理变化。

1.5 图像分析及统计学处理 用Biomias99图像分析系统进行图像分析。实验数据以±s表示，采用SPSS19.0统计软件进行一元方差分析，LSD检验及单因素方差分析。

2 结果

2.1 各组大鼠海马CA1区和大脑皮质病理形态学观察 海马CA1区:HE染色见假手术组大鼠海马CA1区神经元排列整齐、密集，细胞结构正常，胞质丰富，无胶质细胞增生现象;细胞核呈圆形、椭圆形，无变性，无固缩或溶解现象。VD模型组海马CA1区组织明显水肿，出现脑梗死灶，神经元排列紊乱，体积变小，变性严重，胞核与胞质界限不清，部分严重变性坏死。电针组海马CA1区神经元结构正常、轻微水肿，无严重变性。尼莫地平组海马CA1区神经元结构正常、密集，少量水肿，无变性坏死。大脑皮质:HE染色见假手术组大脑皮质组织内无血管扩张，有轻微水肿形成，无出血，无血肿形成，无神经元变性，无神经元坏死，无胶质细胞增生，无坏死灶，无淋巴细胞浸润。模型组大脑皮质组织出现严重水肿，神经元严重变性和坏死，胶质细胞增生明显，大量软化灶形成，有淋巴细胞浸润。电针组大脑皮质组织内无血管扩张，有轻微水肿形成，无出血，无血肿形成，少量神经元变性，少量神经元坏死，无胶质细胞增生，无坏死灶，无淋巴细胞浸润。尼莫地平组大脑皮质组织内无血管扩张，有轻微水肿形成，无出血，无血肿形成，少量神经元变性，无神经元坏死，无胶质细胞增生，无坏死灶，无淋巴细胞浸润。见图1。

2.2 行为学检测结果 模型组大鼠平均逃避潜伏期与假手术组比较明显延长 (P＜0.01)，电针组与模型组相比，平均逃避潜伏期缩短 (P＜0.01，P＜0.05)，与尼莫地平组相比无差异 (P＞0.05)。见表1。模型组与假手术组比较，第Ⅲ象限活动时间缩短、穿越站台次数减少 (P＜0.01)，电针组与模型组比较，第Ⅲ象限活动时间延长、穿越站台次数增多(P＜0.01)，电针组与尼莫地平组比较无差异 (P＞0.05)。见表2。

表1 各组大鼠定位航行实验平均逃避潜伏期(±s，s)

表1 各组大鼠定位航行实验平均逃避潜伏期(±s，s)

与假手术组比较:1)P＜0.01;与VD模型组比较:2)P＜0.05，3)P＜0.01

组别 n 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天假手术组 12 45.56±3.52 27.16±4.04 21.67±4.14 12.53±4.52 7.36±2.31 4.27±3.18 VD模型组 11 57.01±6.82 50.67±5.021) 45.08±6.521) 40.59±6.031) 33.28±7.031) 23.76±7.381)电针组 10 51.49±5.42 42.56±4.182) 34.32±4.632) 21.42±3.683) 18.44±3.363) 12.16±2.293)尼莫地平组 10 47.44±5.73 40.36±3.17 35.47±5.86 20.27±1.50 18.69±3.07 9.35±2.29

表2 各组大鼠空间探索实验第Ⅲ象限活动时间和穿越站台次数(±s)

与假手术组比较:1)P＜0.01;与VD模型组比较:2)P＜0.01

组别 n 第Ⅲ象限活动时间(s) 穿越站台数(次)假手术组12 79.47±12.29 7.36±1.73 VD模型组 11 24.46±10.351) 1.91±0.581)电针组 10 47.63±11.522) 4.87±0.682)尼莫地平组10 50.36±10.38 4.59±1.28

2.3 各组大鼠血浆Aβ含量检测及比较 VD模型组大鼠血浆Aβ含量比假手术组显著升高(P＜0.01)，电针组大鼠Aβ含量虽然也明显高于假手术组(P＜0.05)，但与VD模型组大鼠相比明显降低(P＜0.01)，见表3。提示电针智三针可以降低VD大鼠异常升高的血浆Aβ含量。

2.4 海马CA1区组织病理学积分 与假手术组比较，模型组海马部位的病理积分明显增加(P＜0.01)，电针组海马病理积分与模型组比较显著降低(P＜0.01)，对海马的作用与尼莫地平组相当(P＞0.05)。这说明电针智三针可以有效改善VD大鼠已经变性坏死的神经元细胞，提高大鼠的学习记忆能力。结果见表3。

表3 各组大鼠血浆Aβ含量及海马组织学病理积分(±s)

表3 各组大鼠血浆Aβ含量及海马组织学病理积分(±s)

与假手术组比较:1)P＜0.01，2)P＜0.05;与VD模型组比较:3)P＜0.01

组别 n Aβ含量(ng/ml)海马组织学病理积分假手术组 12 4.37士0.63 7.5±4.63 VD模型组 11 11.48±1.261) 36.67±5.001)电针组 10 6.21±0.262)3) 28.89±3.333)尼莫地平组 10 6.32±2.762) 24.44±5.273)

3 讨论

电针治疗VD的疗效优于目前常用的西药疗法〔5〕。“智三针”由神庭、本神(双)三穴组成，主治小儿智力低下、老年性痴呆、VD、健忘等有关智力方面的疾病疗效显著，提示电针智三针能有效改善VD大鼠学习记忆能力，效果和尼莫地平相当。

各种原因诱发VD的共同通路，是VD形成和发展的关键因素，因此抑制和减少Aβ在脑内沉积是突破VD治疗的关键环节。研究发现，AD患者血清Aβ含量较智能正常老年人明显升高，且与疾病的严重程度呈正相关，表明AD患者可引起淀粉样蛋白异常变化〔6〕。卢雨微等〔7〕研究表明，耳针能减少或抑制Aβ的过度产生，这可能是减少了Aβ的沉积，阻止Aβ装备成有毒性的聚合体，保护神经元免受Aβ的神经毒性，从而改善VD模型大鼠学习记忆。维生素E(VE)可能通过调节早老蛋白(PS-1)的表达来降低Aβ的生成，从而减少神经元的损伤，起到保护作用〔8〕。表明血浆Aβ的增加对脑组织产生了毒性作用，导致了神经元的损伤和变性，电针通过下调血浆Aβ含量，减轻了对脑组织神经元的损伤和变性，增加的学习记忆的能力，且电针智三针的治疗效果接近尼莫地平治疗组，这提示或许可以使用电针替代尼莫地平治疗，或者联合治疗对患者更有利。

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7 卢雨微，吕明庄，贺志光.耳穴埋针对血管性痴呆大鼠记忆障碍及β淀粉样蛋白表达的影响〔J〕.中国针灸，2006;26(11):804-8.

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