氯胺酮对乳鼠海马CA3区神经元凋亡及NMDAR-2B表达的影响

石永勇，贾 彬，招伟贤，李向宇，古妙宁

(1南方医科大学附属南方医院，广州 510515;2广东省中医院)

研究表明，发育中的大脑对氯胺酮非常敏感，持续暴露5 h即足以引起显著的神经元凋亡［1］。氯胺酮 为 N-甲 基-D-天 冬 氨 酸 (N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体拮抗剂，其引起发育中神经元凋亡的确切机制尚不清楚。2011年6月～2012年1月，我们观察了氯胺酮对新生乳鼠海马CA3区NMDA受体表达的影响，探讨氯胺酮引起神经元凋亡的可能机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 氯胺酮(批号:100407，福建古田药业有限公司)，NMDAR-2B抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，凋亡试剂盒购自美国宝灵曼公司(批号:12469500)，MSHOT数码成像系统(广州市明美光电技术有限公司)，Olympus BX50显微镜(Olympus);12只新生7 d的SD大鼠，由广州中医药大学动物实验中心提供。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及标本制作 12只SD大鼠用苦味酸标记后称体质量，随机分为氯胺酮组和对照组各6只。氯胺酮组腹腔注射氯胺酮20mg/kg，间隔90 min再次注射，共计5次;对照组于相应时间点腹腔注射等体积的生理盐水。处理间隙将新生大鼠放回笼中，呼吸空气。第一次注射24 h后，腹腔注射10%水合氯醛深麻醉后，以冰盐水经心脏灌注，灌注至清水流出后以4%多聚甲醛灌注固定。断头取脑，修块后固定于4%多聚甲醛中24 h以上。常规脱水，石蜡包埋，制作4 μm厚切片。

1.2.2 观察项目 ①凋亡细胞密度:采用TUNNEL法。切片常规脱蜡至水，划圈，入蒸馏水;切片放入0.1%TritonX100液室温下8 min:流水冲洗2 min，入PBS洗1 min，3次;滴加标记混合物37度标记60 min;入PBS洗1 min，3次;滴加转换液37℃处理30 min;入PBS洗1 min，3次;BCIP-NBT显色液显色10 min，流水冲洗3 min，擦去组织周围水分，入PBS洗1 min，3次，GVA水溶性封片剂封片，常温晾干。结果判定:凋亡小体呈黑色或紫蓝色位于细胞核内。在200倍显微镜下计算凋亡细胞数，并采用用MIAS医学图像分析管理系统计算凋亡细胞密度。凋亡细胞密度=凋亡细胞数/统计场面积。②海马神经元CA3区NMDA-2B受体表达:采用免疫组化法。切片经纯二甲苯脱腊2次，每次6 min;梯度乙醇脱二甲苯各2 min;自来水漂洗、PBS漂洗各3次，每次2 min;加3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，室温下作用10 min;切片放入已沸腾的柠檬酸修复液中，继续加热至溶液冒小气泡但不沸腾为度，保持10 min;停止加热，冷却至室温约15 min，流水冲洗，PBS液洗2次，擦干切片组织周围表面水分划圈;加入5%BSA封闭液，室温下作用20 min;加入NMDA-2B抗体(1∶40)，37℃恒温箱内1 h;PBS冲洗，3 min ×3次，滴加生物素化二抗，37℃恒温箱内20 min;PBS冲洗，3 min×3次，滴加链霉菌卵白素-辣根过氧化物酶，37℃恒温箱内20 min;PBS洗后加入DAB，显色1～5 min;苏木素浅复染，常规脱水、封片，分析结果。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 海马CA3区元凋亡细胞密度 光镜下可见凋亡细胞体积缩小，凋亡小体呈黑色或紫蓝色位于细胞核内。对照组仅见少量散在的凋亡细胞(图1A)，氯胺酮组可见较多染色质固缩，呈棕黄色的凋亡细胞(图1B)。氯胺酮组和对照组大鼠的凋亡细胞密度分别为 3.252 ±2.330、1.053 ±0.562(P ＜0.05)。

图1 氯胺酮麻醉对新生大鼠海马CA3区神经元凋亡的影响(×200)

2.2 海马CA3区NMDA-2B受体表达 NMDA受体阳性细胞呈散在均匀分布于海马CA3区，DAB显色呈棕黄色。与对照组相比，氯胺酮组阳性细胞明显增多(图2)。图像分析发现对照组光密度值为15.38 ±3.72，氯胺酮组为22.25 ±1.64，两组比较，P=0.0007。

图2 氯胺酮对海马CA3区NMDA受体表达的影响(×100)

3 讨论

氯胺酮是惟一具有镇痛作用的静脉麻醉药，由于其镇痛作用强，对呼吸、循环系统影响轻，在小儿麻醉中得到广泛应用［2，3］。但 1999 年 Ikonomidou等［4］在《科学》杂志报道了包括MK801和氯胺酮在内的NMDA受体拮抗剂可引起发育神经元广泛凋亡后，引起了临床对氯胺酮在小儿麻醉中应用安全性的担忧。

NMDA受体是一种中枢神经系统兴奋性氨基酸离子型受体，具有许多不同变构调控位点并对Ca2+高度通透。在中枢神经系统，NMDA受体主要分布在大脑皮层及海马，尤其以海马最为丰富。在中枢神经发育的过程中，NMDA受体通过不同亚型的选择性表达而改变自身的结构和功能，进而影响NMDA受体介导的Ca2+内流，调节神经元内Ca2+依赖的第二信使系统，最终实现对中枢神经系统发育过程的复杂调控。在未成熟大脑中，NMDA受体活性对于神经元存活至关重要。既往研究表明，阻断这些受体可引起新生动物神经细胞凋亡。

近年来的研究证实，年幼动物接受氯胺酮全身麻醉可引起大脑神经元凋亡，引起学习记忆功能损害［5］。本研究结果显示，氯胺酮干预后大鼠海马CA3区神经元的凋亡显著增加;重复注射氯胺酮可引起新生大鼠海马NMDA-2B受体表达明显增加，与其他学者研究结果一致［6］。据此我们认为，长时间暴露于氯胺酮环境中可触发发育中神经元凋亡增加，其机制可能与氯胺酮引起NMDA受体表达上调有关。

［1］Brambrink AM，Evers AS，Avidan MS，et al.Ketamine-induced neuroapoptosis in the fetal and neonatal rhesus macaque brain［J］.Anesthesiology，2012，116(2):372-384.

［2］刘俊锋，崔万红.咪唑安定、氯胺酮口服在小儿手术基础麻醉中的应用效果观察［J］.山东医药，2010，50(34):103-104.

［3］张国生，武巧月，王娟，等.小剂量氯胺酮、瑞芬太尼在婴幼儿唇腭裂手术中的麻醉效果观察［J］.山东医药，2009，49(38):103-104.

［4］Ikonomidou C，Bosch F，Miksa M，et al.Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain［J］.Science，1999，283(5398):70-74.

［5］Hayashi H，Dikkes P，Soriano SG.Repeated Administration of Ketamine May lead to Neuronal Degeneration in the Developing Rat Brain［J］.Paediatric Anaesthesia，2002，12(9):770-774.

［6］Shi Q，Guo L，Patterson TA，et al.Gene expression profiling in the developing rat brain exposed to ketamine［J］.Neuroscience，2010，166(3):852-863.