贵州黔南烟草马铃薯Y病毒（PVY）株系的血清学鉴定

罗红香，李余湘，刘会忠，徐明勇，王林玉，赵中汇，何玉安，李章海，江 彤

（1.贵州省黔南州烟草公司，贵州 都匀 558000；2.中国科学技术大学烟草研究中心，合肥 230051；3.安徽农业大学植保学院，合肥 230036）

马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的典型成员，能侵染烟草、马铃薯、番茄和辣椒等多种茄科作物[1]。根据PVY的鉴别寄主症状反应和血清学反应类型，进一步将其划分为多个株系，常见的有PVYO、PVYN和PVYC等株系。PVYO在不同马铃薯品种上引起轻重不一的花叶，而在烟草上引起斑驳和花叶；PVYN在马铃薯上一般表现为叶片无症或轻型斑驳，而在烟草上引起叶脉和叶柄坏死；PVYC在马铃薯栽培品种上引起条痕花叶症状[2-3]。

我国植病工作者在上世纪 90年代以来也做过一些PVY株系鉴定工作。吴元华等[4]鉴定东北烟区烟草上发生的 PVY有普通株系（PVYO）、脉坏死株系（PVYVN）、点刻条斑株系（PVYC）和茎坏死株系（PVYNS）4个株系。王劲波等[5]鉴定山东烟区主要有PVYO和PVYN2个株系。江彤等[6]鉴定安徽烟草可能存在PVYO株系和PVYNTN株系。由于PVY不同株系发生复合侵染以及不断发现新的PVY株系和亚株系，PVY株系的鉴定变得越来越复杂。PVY侵染烟草引起的马铃薯Y病毒病在国内烟区广泛分布[7-8]，特别在东北烟区和黄淮烟区危害严重[9-10]，大幅度降低烟叶产量和质量，成为阻碍烟叶生产的瓶颈。近年来，贵州省烟草马铃薯Y病毒也呈现逐年加重趋势，特别是黔南烟区 PVY大面积流行，在局部地区甚至造成毁灭性损失[11]。

为减轻贵州黔南烟草病毒病危害，摸清当前贵州黔南烟区马铃薯Y病毒病发生发展的变化趋势，鉴定黔南烟区 PVY株系已成为当务之急。本研究采用以 Tas-ELISA为主的血清学检测手段来鉴定PVY株系，血清学鉴定方法较快速且可短时间鉴定大量样本，因此，利用血清学方法加强对黔南烟草上 PVY的株系变化进行系统鉴定和检测，明确黔南烟草 PVY株系的分布，将为选育适合黔南烟区PVY重病区种植的抗病品种以及制定烟草PVY的防治措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病样来源 2010年从贵州省黔南州瓮安、福泉、贵定、龙里4个县烟草产区共采集201个表现明显马铃薯Y病毒病症状的烟草样本。样本表现为叶脉坏死、叶缘纵向下卷、叶片叶面皱缩、脉间轻花叶、矮化等症状。其中瓮安县珠藏镇、牛场坝乡；福泉县龙昌镇；贵定县新浦乡、新巴镇；龙里县巴江乡、洗马镇的样本数分别为34、28、36、44、7、27、25个。

1.1.2 试剂 马铃薯 Y 病毒各个株系诊断试剂：Potato Virus Y necrotic strain Reagent Set，Potato Virus Y strain C Reagent Set，Potato Virus Y strains O and C Reagent Set（美国Agdia公司）；碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG（Promega公司）；硝基苯磷酸酯钠盐（Sigma公司）；96孔酶标板（美国Corning公司）。

1.2 试验方法

Tas-ELISA检测方法参照Agdia公司马铃薯Y病毒各个株系诊断试剂使用说明并略加调整。PVY多克隆抗体1:200稀释后分别包被酶标板，4 ℃孵育过夜；加入1:10稀释的病汁液样品，25 ℃孵育2 h；加酶标记物稀释液（含A酶标抗体和B酶标抗体），25 ℃孵育2 h；硝基苯磷酸酯钠盐（PNP）显色，25 ℃孵育1 h，酶标仪测定吸光值（OD405）。每步用含吐温的磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤3～5次，测定时每个样品均设2次重复。

2 结 果

黔南州瓮安、福泉、贵定、龙里4县201个烟草样本的ELISA检测结果见表1。从表1可看出，201个样本中，共检测出171个样本受到PVY侵染，阳性率为85.1%。其中瓮安、福泉、贵定、龙里PVY的阳性率分别为88.7%、75.0%、80.4%、92.3%。

171个受PVY侵染的样本中，PVYN37个，占21.6%；PVYO133个，占77.8%；PVYC0个，PVYN和 PVYO复合侵染 1个，占 0.6%。其中，瓮安县55个阳性样本全部是PVYO，占100%；福泉县27个阳性样本中，PVYN占11.1% ，PVYO占88.9%；贵定县 41个阳性样本中，PVYN占 34.1%，PVYO占65.9%；龙里县48个阳性样本中，PVYN占41.7%，PVYO占56.3%，PVYN和PVYO复合侵染占2.1%。侵染黔南州烟草的 PVY株系分布具有一定规律，PVYO在4县分布均为主要株系，PVYN侵染相对较少，为次要株系，所有样本均没有检测到PVYC侵染，复合侵染零星发生。

表1 贵州省黔南州201个烟草样本的PVY株系鉴定结果Table 1 The results of ELISA detection of 201 of tobacco samples from Qannan, Guizhou

3 讨 论

从贵州省黔南州瓮安、福泉、贵定、龙里4县采集烟草样本时发现，黔南烟区疑似感染 PVY的烟株普遍表现为叶脉坏死、叶缘纵向下卷、叶片叶面皱缩、脉间轻花叶、矮化等症状。ELISA检测进一步证明，叶片背面支脉坏死的烟株基本都能检测到 PVY的侵染，但 PVY在烟草上的症状表型与PVY株系之间没有明确的关系，无论 PVYN还是PVYO都在烟草上表现出叶脉坏死症状。因此，根据脉坏死症状仅可以初步诊断烟株受到PVY侵染，但无法确定 PVY的株系，必须进一步通过血清学检测才可以明确PVY的株系类型。

本试验采用 Tas-ELISA检测了黔南烟草 PVY的3个株系PVYN、PVYO和PVYC，发现侵染黔南烟草的PVY以PVYO为主，PVYN为次要株系。黔南 PVY株系分布在该地区具有一定规律，瓮安县位于黔南州的最北部，感染瓮安烟草的 PVY样本全部是PVYO，没有检测到PVYN侵染；福泉县位于瓮安县南部，该县烟草样本以PVYO侵染为主，也能检测到少量PVYN侵染。贵定县的新浦乡、新巴镇以及龙里县的巴江乡、洗马镇相距不远，位于黔南州的西部。总体上，这4个乡镇烟草样本仍然以 PVYO侵染为主，但龙里县巴江乡烟草样本以PVYN侵染为主，占66.7%（数据未列出），与其他地方PVYO为优势株系有差异。贵定县新巴镇烟草PVY发病很轻，田间病株率低于1%（数据未列出），可能与该镇处于相对较封闭的山区，高带毒率的介体蚜虫尚没有大量迁入有关。

笔者在黔南州采样时，也做了PVY病情普查。瓮安县PVY发病最为严重，发病田块病株率30%～70%（数据未列出）不等，病情特别严重田块呈枯黄一片，后期无法控制，烟农甚至弃烤。有的烟农因为马铃薯 Y病毒病损失巨大，不愿意再种植烤烟，PVY造成的危害和损失在黔南烟区已成为烤烟生产瓶颈。因此，明确黔南烟草 PVY株系分布，为筛选出适合黔南烟草 PVY重病区种植的抗病品种具有重要意义。鉴于黔南烟区以PVYO为优势株系，进行地方性品种抗病性选育时，就应该选择PVYO作为接种毒源。另外，黔南PVY株系种类可能随蚜虫的迁飞或烤烟品种的改变发生变化，因此，还需要继续监测黔南烟草PVY株系的变化。

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