孕酮调节乳腺癌耐药蛋白的机制研究*

张玉华，李 光，俞 进，徐妙生，李洪利

(首都医科大学附属北京天坛医院病理科，北京 100050)

乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP/ABCG2/MXP)是一种近来新发现的多药耐药蛋白，属于ATP结合盒(adenosine triphosphate－binding cassette，ABC)膜转运蛋白超家族［1－2］。作为细胞膜上的药物排出泵，可将细胞毒性药物转运至胞外，BCRP的过表达可以导致肿瘤细胞对多种化疗药物产生耐药［3－5］。而新近对BCRP基因启动子的研究发现，在BCRP启动子的上游5'端的区域具有正性和负性调控区域，并发现存在一个孕激素反应元件(progesterone response element，PRE)［6－8］。该反应元件与乳腺癌细胞中BCRP的表达密切相关，因此孕激素可能通过与BCRP启动子上游的PRE结合，调控BCRP基因的表达。近期的研究也显示了一些能够调节BCRP表达的药物，其中包括雌激素的类似物和拮抗剂，但目前对孕激素调控BCRP的具体机制及作用效应尚不明确。因此，本实验选择孕激素和BCRP基因为研究对象，通过药物诱导或基因转染的方法，建立由BCRP启动子或巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子启动表达BCRP的4种耐药细胞系。将孕酮(progesterone，P4)加入耐药细胞系的培养液中，观察其对不同细胞系BCRP表达的影响，并深入探讨孕酮对BCRP基因的效应和可能的分子调控机制。

材料和方法

1 材料

1.1 细胞株 人乳腺癌细胞株PR阳性的T47D和PR阴性的MDA－MB－231由中国医学科学院提供，均来源于美国国立癌症研究所(National Cancer Institute)。

1.2 主要试剂 Progesterone、RU486、G418及四甲基偶氮唑盐［3－(4，5－dimethythiazol－2－yl)－2，5－diphenyltetrazolium bromide，MTT］均购自Sigma;pcDNA3载体由本实验室保存;质粒提取试剂盒为Qiagen产品;LipofectamineTM2000试剂盒购自Invitrogen;Trizol reagent和RT－PCR kit为TaKaRa产品;BCRP抗体(BXP－53)购自Abcam;辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgGⅡ抗购自北京中杉生物技术公司;DMEM和胎牛血清为Gibco产品;引物由上海生工生物公司合成;米托蒽醌(mitoxantrone，MX)购自江苏恒瑞制药股份有限公司;二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)为启光试剂公司产品。

2 方法

2.1 细胞培养 人乳腺癌细胞株孕酮受体(progesterone receptor，PR)阳性的T47D和PR阴性的MDA－MB－231在含有10%胎牛血清及青霉素、链霉素各105U/L的DMEM培养液中常规培养(37℃、5%CO2)。0.25%胰酶(含0.02%EDTA)混合液消化，每2～3 d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

2.2 米托蒽醌诱导耐药细胞系T47D/MX和MDA－MB－231/MX的建立 米托蒽醌诱导筛选乳腺癌细胞T47D和MDA－MB－231，在含有10%胎牛血清的DMEM培养液中加入米托蒽醌，首先起始浓度为8 μg/L，细胞传3代后，逐渐增加米托蒽醌的筛选浓度至 20 μg/L、40 μg/L、80 μg/L 和 100 μg/L［9］，最终建立由BCRP启动子启动表达BCRP的2种耐药细胞系:PR阳性的T47D/MX和PR阴性的MDA－MB－231/MX。

2.3 脂质体Lipofectamine 2000介导质粒转染乳腺癌细胞建立T47D/CMV－BCRP和MDA－MB－231/CMV－BCRP耐药细胞系 重组质粒pcDNA3－CMV－BCRP含有CMV启动子和野生型BCRP基因，由美国Marryland大学的Douglas Ross教授惠赠，本实验室保存。将质粒pcDNA3－CMV－BCRP转染PR阳性的T47D和PR阴性的MDA－MB－231乳腺癌细胞系，并经350 mg/L G418筛选后，建立由CMV启动子启动表达BCRP的2种耐药细胞系:PR阳性的T47D/CMVBCRP和PR阴性的MDA－MB－231/CMV－BCRP。这2种细胞作为对照。

2.4 不同药物处理细胞 T47D/MX、T47D/CMV－BCRP、MDA－MB－231/MX和MDA－MB－231/CMV－BCRP 4种细胞株按常规方法培养。选对数生长期细胞用于实验，每株调整细胞数为2×105接种于24孔板，每组设3个平行复孔。实验分组:(1)空白组:只加细胞不加药物;(2)孕酮单独作用组:细胞接种 24 h后，加入不同浓度(10－7mol/L 、10－6mol/L、10－5mol/L)的孕酮继续培养96 h;(3)孕酮和RU486联合作用组:细胞接种24 h后，加入10－5mol/L孕酮，48 h后再加入10－5mol/L RU486，继续培养48 h。药物和培养基每24 h更换1次，72 h后收集细胞进行检测。

2.5 RT－PCR检测BCRP mRNA的表达水平 UNIQ－10柱式总RNA抽提试剂盒提取实验组和对照组细胞的总RNA，紫外分光光度仪测定260 nm和280 nm波长的吸光度值(A)，计算 RNA纯度(A260/A280=1.8～2.0)及 RNA 含量。根据引物分析软件自行设计:BCRP引物正义链5'－TGGCTGTCATGGCTTCAGTA －3'，反义链5'－GCCACGTGAT TCTTCCACAA－3'，扩增片段为235 bp;内参照GAPDH引物正义链5'－CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT －3'，反义链 5'－AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC －3'，扩增片段为 307 bp。逆转录体系为20 μL，其中含4 μg RNA 样本，1 μL 随机引物，2 μL dNTP混合物，1 μL逆转录酶，反应条件为30℃ 10 min，45℃ 30 min，99℃ 5 min。随后产物进行PCR扩增，反应体系为 100 μL，其中逆转录产物5 μL，Tap 酶0.5 μL(5 ×106U/L)，BCRP上、下游引物各 10 μL，GAPDH 上、下游引物各 10 μL。95 ℃预变性3 min，94 ℃ 5 min，95 ℃ 50 s，52 ℃ 30 s，72℃ 1 min，循环32次，72℃5 min。取PCR产物20 μL进行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统分析，BCRP指数=BCRP灰度值/GAPDH灰度值，该指数与BCRP mRNA的量成正比，进行BCRP mRNA表达水平的半定量分析。

2.6 Western blotting检测BCRP蛋白的表达变化 各组细胞加入细胞裂解液，按常规方法提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。取50 μg蛋白变性、电泳、转至硝酸纤维素膜，丽春红染色，5%脱脂牛奶封闭，洗膜后加Ⅰ抗BCRP(1∶1000)或GAPDH(1∶5000)4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶(HRP)标记的Ⅱ抗IgG(1∶4000)孵育2 h，ECL化学发光试剂盒于暗室自显影。实验以GAPDH为参照，采用BandScan 5.0软件测量特异条带的灰度值，以目的条带的灰度值与对应GAPDH灰度值之比表示BCRP蛋白的含量。

2.7 米托蒽醌外排实验检测BCRP的转运功能 米托蒽醌是BCRP特异性转运的荧光物质，当实验细胞的BCRP转运功能降低时，米托蒽醌在细胞内聚集，荧光强度高于耐药细胞［9］。常规胰酶、EDTA消化各组细胞，制备细胞悬液并转移至24孔板。细胞培养在含10%胎牛血清的完全培养基DMEM或含有20 μmol/L米托蒽醌和10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5%CO2培养箱中孵育30 min。收集实验组和对照组细胞，流式细胞仪检测细胞内米托蒽醌的荧光强度。

3 统计学处理

数据采用SPSS 16.0统计软件进行分析处理。每次实验相同条件重复3次，实验数据以均数±标准差()表示。多样本均数之间的比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 孕酮对不同细胞组BCRP基因mRNA表达的影响

RT－PCR结果显示，与未处理组相比，孕酮以剂量依赖方式增强BCRP mRNA的表达，孕酮处理组在浓度10－7、10－6和10－5mol/L时，T47D/MX细胞中BCRP mRNA的条带明显增强，表达水平上调，分别是未处理组的2.64倍(P＜0.05)、4.71倍(P ＜0.05)和 7.95倍(P ＜0.01)倍，见图 1A;10－5mol/L孕酮和10－5mol/L RU486联合处理组，T47D/MX细胞中BCRP mRNA的表达水平显著低于10－5mol/L孕酮单独处理组(处理前后相对BCRP mRNA表达率:231.8% ±2.4%vs 74.9% ±1.3%，P＜0.01)，见图1A。这提示孕酮对 BCRP mRNA表达的增强效应，可被其拮抗剂RU486阻断，两药之间存在拮抗作用。而对照组T47D/CMV－BCRP细胞，处理前后细胞中BCRP mRNA的表达水平无明显差异(P＞0.05)，见图1B;且对照组MDA－MB－231/MX和MDA－MB－231/CMV－BCRP细胞，各组处理前后相比，BCRP mRNA表达量无明显变化，差异无统计学意义(P＞0.05)。

2 孕酮对不同细胞组BCRP蛋白表达的影响

Western blotting结果显示，与未处理组相比，10－7、10－6和10－5mol/L孕酮以剂量依赖方式增强T47D/MX细胞中BCRP蛋白的表达，增加倍数分别为1.94(P＜0.05)、4.65(P＜0.05)和7.02(P ＜0.01)，见图 2A;10－5mol/L 孕酮和 10－5mol/L RU486联合处理组，T47D/MX细胞中BCRP蛋白的相对表达水平为46.2% ±1.3%，明显低于10－5mol/L孕酮单独处理组(相对 BCRP蛋白表达率:147.9% ±3.2%，P＜0.01)，见图2A，两药之间存在拮抗作用。而对照组T47D/CMV－BCRP细胞，处理前后细胞中BCRP蛋白的相对表达水平无明显差异(P＞0.05)，见图2B;且对照组MDA－MB－231/MX和MDA－MB－231/CMV－BCRP细胞，处理方法同前，各组处理前后相比，BCRP蛋白的含量无明显改变，差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 孕酮对不同细胞组BCRP转运功能的影响

米托蒽醌是BCRP的特异性转运底物，常用于检测BCRP的外排功能。米托蒽醌外排实验结果显示，与未处理组相比，10－5mol/L孕酮单独处理组，T47D/MX细胞内米托蒽醌荧光强度显著降低，峰值左移，见图3A，外排米托蒽醌的能力升高了41.7%(处理前后相对米托蒽醌荧光强度:100.0%，141.7% ±6.4%，P ＜0.05)，见图 3A、表1;10－5mol/L 孕酮和10－5mol/L RU486联合处理后，T47D/MX细胞内的米托蒽醌荧光强度明显高于孕酮单独处理组，峰值右移，见图3A，外排米托蒽醌的能力降低了20.3%(处理前后相对米托蒽醌荧光强度:141.7% ±6.4%vs 112.9% ±5.2%，P ＜0.05)，见图3A、表1，两药之间存在拮抗作用;而对照组T47D/CMV－BCRP、MDA－MB－231/MX和MDA－MB－231/CMV－BCRP细胞，各组处理前后相比，细胞中米托蒽醌荧光强度无明显改变(P＞0.05)，见图3B、表1。

Figure 1.Effects of progesterone on BCRP mRNA expression in T47D/MX and T47D/CMV－BCRP cells..n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control(0 mol/L P4+0 mol/L RU486);##P＜0.01 vs 10－5mol/L P4+10－5 mol/L RU486.图1 孕酮对T47D/MX和T47D/CMV－BCRP细胞BCRP mRNA表达的影响

讨 论

Figure 2.Effects of progesterone on BCRP protein expression in T47D/MX and T47D/CMV－BCRP cells..n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control(0 mol/L P4+0 mol/L RU486);##P＜0.01 vs 10－5mol/L P4+10－5 mol/L RU486.图2 孕酮对T47D/MX和T47D/CMV－BCRP细胞BCRP蛋白表达的影响

BCRP是新近发现的与肿瘤多药耐药相关的一种跨膜转运蛋白，与P－糖蛋白(P－glycoprotein，P－gp)同属于ABC转运蛋白超家族。ABC转运蛋白是一种能量依赖性药物排出泵，消耗ATP将细胞内的药物泵出，减少细胞内药物浓度，降低药物对肿瘤的杀伤作用。高表达BCRP的肿瘤细胞株对米托蒽醌、阿霉素、柔红霉素等多种化疗药物可产生交叉耐药［3－5］，该蛋白在多药耐药方面逐渐引人关注。人类的BCRP基因首次在乳腺癌耐药细胞株MCF－7/AdrVp的DNA文库中发现而命名，定位于染色体4q22区域，含有1个开放阅读框架。BCRP基因的转录产物mRNA长约2.4 kb，编码655个氨基酸残基、72.6 kD的蛋白质。BCRP蛋白仅含有1个跨膜区域和1个ATP结合位点，在空间结构上仅相当于完全转运蛋白P－gp分子的一半，故称为半转运蛋白［10］。因此，有学者认为BCRP是耐药蛋白的基本结构，了解BCRP的作用机制对于研究其它耐药蛋白大有帮助。

近来有研究报道，孕激素、雌激素的类似物或拮抗剂可以逆转K562/BCRP细胞中BCRP介导的多药耐药，如孕酮、雌二醇、三苯氧胺［11－12］，其机制可能是作为BCRP的底物，竞争性抑制BCRP与其它抗肿瘤药物结合。2004年，Ee等［7］发现在BCRP基因启动子区的5'端侧翼序列的－243至－115之间含有1个雌激素反应元件(estrogen response element，ERE)结构，该反应元件与乳腺癌细胞中BCRP的表达密切相关。而最新分析认为［8］，胎盘绒毛膜细胞癌中BCRP启动子区的ERE同时也是一个PRE，孕酮可能通过PR与BCRP启动子区的PRE相结合，增强BCRP的表达。关于孕激素对BCRP基因的具体作用机制及影响，以往的研究报道缺乏一致性结果。因此，孕激素及其受体在BCRP表达调控中的作用过程、影响因素及综合效应目前尚不十分清楚。

我们前期实验显示，托瑞米芬可通过ERα介导抑制BCRP基因的启动子而减弱BCRP转录活性，降低ERα阳性乳腺癌细胞中BCRP mRNA和蛋白的表达水平，进而逆转BCRP 介导的多药耐药［13］。

本实验通过药物诱导和基因转染的方法，作用于孕激素受体阳性的T47D和PR阴性的MDA－MB－231乳腺癌细胞系，成功建立了分别由含PRE的BCRP启动子和不含PRE的CMV启动子启动表达BCRP的4种耐药细胞系T47D/MX、T47D/CMV－BCRP、MDA－MB－231/MX和MDA－MB－231/CMV－BCRP，观察孕酮对不同的乳腺癌耐药细胞系BCRP表达的影响，尚未见相关报道。

本研究结果发现，孕酮能够在转录水平明显增强T47D/MX细胞中BCRP mRNA的表达，但却不能抑制T47D/CMVBCRP、MDA－MB－231/MX和MDA－MB－231/CMVBCRP细胞中BCRP mRNA的表达水平。分析存在差异的原因:前者T47D/MX细胞中BCRP的表达是由含PRE的BCRP启动子启动表达，且细胞是PR阳性的;而后者T47D/CMVBCRP细胞中BCRP表达是由不含PRE的CMV启动子启动表达;且 MDA－MB－231/MX和 MDA－MB－231/CMVBCRP细胞是PR阴性的。这提示，孕酮不是作为BCRP的底物调节其功能，而可能是通过PR的介导与BCRP启动子区的PRE序列结合，激活BCRP基因启动子而增强BCRP基因mRNA的转录。本研究通过Western blotting测定了BCRP蛋白的表达水平，米托蒽醌外排实验检测了BCRP的转运功能。结果显示，孕酮显著上调PR阳性乳腺癌细胞中BCRP蛋白的表达，明显升高细胞外排米托蒽醌的能力。

然而，由于PR亚型PRA和PRB受体的存在，并可通过PRE与AP1位点2种方式介导信号转导，使得PR介导的信号转导过程更为复杂。在孕酮调控BCRP的过程中，是以某一种信号转导通路为主还是几种信号转导通路共同发挥作用?几种信号转导通路之间是否存在相互影响?尚未见报道，将成为今后深入研究的方向。

Figure 3.Effects of progesterone on the intracellular accumulation of mitoxantrone in T47D/MX and T47D/CMV －BCRP cells.图3 孕酮对T47D/MX和T47D/CMV－BCRP细胞BCRP转运功能的影响

表1 孕酮对各组细胞BCRP外排米托蒽醌的影响Table 1.Effects of progesterone on BCRP－mediated mitoxantrone efflux activity

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