用原子力显微镜观察术中失血回收对红细胞形态的影响*

黄 艳，聂 偲，田玲玲，胡冬华，彭雪梅，王小平，李雅兰

(暨南大学附属第一医院麻醉科，广东 广州 510630)

原子力显微镜(atomic force microscope，AFM)通过扫描探针与样品表面间的微小作用力而得到样品的表面形貌信息。该技术从三维的角度描述样品表面的微观结构及相关信息，不受样品是否有导电性的限制，且样品制备简单，具有亚纳米级的超高分辨率，因此已被广泛用于生物医学、细胞生物学和材料学等领域［1］。

术中失血回收(intraoperative blood savlage，IOBS)是指将外伤和手术中流出的大量血液收集后经过滤、离心、洗涤，收集浓缩后的红细胞给病人回输。一般60%～70%的失血可以通过此方法回收。此方法对减少异体输血相关的感染性和非感染性并发症，保护血资源起到积极的作用，目前已经广泛应用于临床［2］。与此同时，洗涤过程对红细胞的影响也日益引起人们的关注。本文旨在应用原子力显微镜观察脊柱手术中经自体血液回收处理后红细胞的外貌，为临床应用回收式自体输血的安全性和可行性提供实验依据。

材料和方法

1 病例选择

选取2011年5～7月暨南大学附属第一医院择期行脊柱手术的患者10例，男5例，女5例，年龄35～65岁。美国麻醉医师协会(American Society of Anesthesiology，ASA)体格情况分级I～Ⅲ级，既往均无恶性肿瘤及无血液系统疾病，无高血脂及血电解质异常。既往有高血压病史者均已在术前予以控制，其它常规化验检查均正常。

2 麻醉方法

麻醉前30 min肌注阿托品0.5 mg和苯巴比妥100 mg。所有患者均采用静脉全麻。异丙酚和瑞芬太尼维持麻醉，阿曲库铵间断静脉注射维持肌肉松弛。术中输注复方乳酸钠林格氏液和6%羟乙基淀粉维持血容量及循环稳定。

3 自体血回收操作

手术常规操作并安装好血液回收机(自体－30COP型，北京京精医疗设备公司)，一次性使用血液回收套件(FCR－2000F型，宁波菲拉尔医疗用品有限公司)，术前以肝素盐水(肝素钠25000 U加入生理盐500 mL)预冲双腔管道及回收罐，患者的术野活动性出血由连接中心负压吸引(－150～－200 mmHg)至血液回收罐，回收血液与抗凝剂的容积比为10∶1，回收血液经离心(5000 r/min)、清洗(生理盐水与回收血液容积比为3∶1)，通过半透膜过滤，去除清洗液、细胞碎片、脂肪滴、异物、游离血红蛋白、血浆及抗凝剂，浓缩后红细胞压积为30% ～40%，回输给患者。血液回输量200～700 mL。

4 取材

收集所有患者手术开始前外周静脉血2 mL(T1)，洗涤前血液2 mL(T2)，洗涤后血液2 mL(T3，洗涤后指清洗完毕，红细胞悬液自动泵入输血袋内储存)，回输洗涤血1 h后外周静脉血2 mL(T4)。以上所有标本均以肝素钠(1×10 U/L)抗凝，置于15 mL离心管中，4℃冰箱保存。

5 红细胞样本的制备

将血样从冰箱中拿出，在室温恢复约1 h，离心(3500 r/min)10 min，弃上层血浆及白细胞层，缓慢轻轻沿离心管壁将红细胞置于离心管内10倍体积量的等渗pH 7.40的PBS缓冲液，每次离心(2000 r/min)5 min，除去上清液及沉淀表层白色绒毛，重复洗涤3次。最后将红细胞再悬浮于PBS中制成细胞压积为1%的细胞，取20 μL此悬液滴于干净的盖玻片上，1%的戊二醛固定15 min，之后蒸馏水冲洗去除固定液7次，防止形成盐结晶，多余的水分用滤纸吸干，室温下自然风干。

6 荧光正置显微镜观察红细胞

取4个时点的红细胞，在400倍放大率下浏览整个玻片，随机选取1000个细胞疏密程度适中，计数红细胞总数及异常细胞数，计算红细胞畸形率，即球形、椭圆形、梨形、花瓣形红细胞以及破碎红细胞的百分比，取均数作比较。

7 AFM观察红细胞

样品干燥后置于NanoScopeV AFM(Veeco instruments)载物台上，利用Olympus倒置显微镜观察血细胞的分散情况，选择分散均匀的区域在空气中应用AFM进行扫描成像。控制湿度为50% ～60%，Nanoscope 8.10 Catalyst模式，Tap150AI－G 硅探针(Resonant Freq 150 kHz，Force Constant 5 N/m)。每种样本扫描20个细胞5个区域;每个区域扫描范围为30 μm～1 μm，扫描顺序依次为30 μm、整个红细胞、红细胞膜表面周边扫描1 μm大小的区域，扫描速率为0.15～0.7 Hz。平滑处理扫描之后的图像，以消除慢扫描方向的噪音。

8 统计学处理

实验结果应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，利用One－way ANOVA分析方法，数据以均值±标准差()表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

荧光正置显微镜下多个红细胞的形貌如图1所示。术前静脉血、洗涤前血液、洗涤后血液和回输后静脉血的红细胞畸形率分别为(2.2±1.8)%、(9.1±0.9)%、(7.4±1.5)%和(6.8±1.4)%。T1时点的红细胞畸形率低于T2、T3、T4(n=10，P＜0.05)，而后三者红细胞畸形率并无显著差异。

AFM下单个红细胞的形貌结果见图2～5。图2显示术前的红细胞形态完整，轮廓清晰，弧度流畅，富有光泽，中间凹陷明显;表面积与体积的比值较大，有利于细胞变形、气体交换和携带;膜比较柔软，容易发生变形;经测量，直径为8.946 μm，厚度为1.601 μm。图3显示洗涤前红细胞虽然仍为双凹圆盘状，但呈肿胀状态;中间凹陷处不明显，无规则，存在重叠及褶皱;经测量，直径为7.918 μm，表面最高高度为2.053 μm。图4显示洗涤后红细胞虽然仍为双凹圆盘状，中间凹陷处明显，但膜表面有不规则突起及破损;经测量，直径为7.932 μm，表面最高高度为1.591 μm。图5显示回输后红细胞基本为双凹圆盘状，膜表面比较光滑;经测量，直径为7.962 μm，表面最高高度为 1.701 μm。

Figure 1.Different red blood cells viewed with fluorescent microscope(×400).A:blood before operation;B:unprocessed blood in cell saver;C:processed blood in cell saver;D:blood 1 h after IOBS.图1 荧光正置显微镜下4个时点的红细胞形貌图

Figure 2.AFM topography and height profile of red blood cell before operation.A:AFM topography of the cell;B:3D image of figure A;C:the height profile of the corresponding line in figure A.图2 术前红细胞的AFM的形貌图及细胞高度曲线图

Figure 3.AFM topography and height profile of unprocessed red blood cell in cell saver.A:AFM topography of the cell;B:3D image of figure A;C:the height profile of the corresponding line in figure A.图3 洗涤前红细胞AFM的形貌图及细胞高度曲线图

Figure 4.AFM topography and height profile of processed red blood cell in cell saver.A:AFM topography of the cell;B:3D image of figure A;C:the height profile of the corresponding line in figure A.图4 洗涤后红细胞AFM的形貌图及细胞高度曲线图

Figure 5.AFM topography and height profile of red blood cell 1 h after IOBS.A:AFM topography of the cell;B:3D image of figure A;C:the height profile of the corresponding line in figure A.图5 回输后1 h红细胞AFM的形貌图及细胞高度曲线图

以上结果表明，红细胞经过术野负压吸引、过滤、离心、洗涤、收集、浓缩后，引起细胞膜的改变，虽然红细胞在外貌上仍保持双凹的特征，其膜表面无明显破裂，但是出现了肿胀现象，即在表面积不明显变化的情况下，细胞的体积变大，表面积与体积的比变小。部分细胞局部凸起，形态不规则，非双凹圆盘状，更有甚者细胞完全变形，破裂，可见细胞碎屑。回输后血液红细胞外貌基本上与术前一致。

AFM下红细胞膜表面超微结构(周边1 μm×1 μm的区域)见图6。术前血红细胞膜表面颗粒分布密集、连续，呈麦穗状结构，没有明显缝隙，膜表面基本没有孔洞，膜结构致密。回收血红细胞膜表面颗粒分布紊乱，堆积型条索状隆起与凹陷，呈不典型的多聚体与单体杂乱分布的颗粒及孔洞形貌，个别孔洞较深，较宽。回输后血红细胞基本与术前一致。与静脉血相比，回收血表面平均粗糙度均增大，见表1。

Figure 6.AFM morphological images of blood(1 μm ×1 μm).A:blood before operation;B:unprocessed blood in cell saver;C:processed blood in cell saver;D:blood 1 h after IOBS.图6 4个时点的红细胞膜超微结构(周边1 μm×1 μm 的区域)

表1 不同时点的红细胞膜表面Ra和Rq的比较Table 1.Comparison of Ra and Rq of erythrocytes(nm..n=10)

表1 不同时点的红细胞膜表面Ra和Rq的比较Table 1.Comparison of Ra and Rq of erythrocytes(nm..n=10)

Ra:profile arithmetic average error;Rq:root mean square roughness.*P ＜0.05 vs other groups.

Group Ra Rq Blood before operation 4.05 ±0.53 5.07 ±0.65 Unprocessed blood 16.40 ±5.04* 20.24 ±5.89*Processed blood 4.51 ±0.81 5.73 ±1.69 Blood 1 h after IOBS 4.38 ±2.58 2.53 ±3.19

讨 论

近10年来，原子力显微技术被广泛应用于医学领域，主要原因是具有其它技术所没有的优势，如:样品制备简单，甚至不需要处理细胞样品，对柔软的细胞样品的破坏微小，可对液体或近生理状态下的细胞样品进行观察，使被测样品保持其生物活性等等。而高分辨率(1 nm，电子显微镜10 nm)的特点使其更好地被应用于研究单个生物大分子和细胞膜表面微观结构。许多光镜和电镜所不能及的细小结构，如单个细胞表面突起或颗粒大小在AFM中可以一目了然。

自体血回输在临床上使用的范围也不断扩大。Catling等［3］对肿瘤病人进行血液回输研究发现，回输血液经过白细胞过滤器后没有找到肿瘤细胞，仅仅发现一些肿瘤细胞碎片，而这些碎片并不能导致肿瘤的转移。最新研究也表明，自体血回输没有增加肠内容物污染及全身败血症患者术后的感染，所以感染患者并不应视为自体血回输的绝对禁忌证［4－5］。因此，国外很多临床医生认为使用IOBS唯一的禁忌症就是患者拒绝［6］。虽然IOBS在临床上有如此广泛的应用，但关于洗涤后红细胞质量方面的研究结果不一致。因此本研究通过AFM观察回收处理前后红细胞表面超微结构变化，了解血液回收对红细胞形态及功能的影响。

红细胞是血液中数量最多的血细胞，正常的成熟红细胞无核，呈双凹圆盘状，直径为7～9 μm。而这个特殊的形状是影响红细胞变形能力、悬浮稳定性和渗透脆性的重要因素，因为红细胞中心到大部分表面的距离都很短，具有较大的气体交换面积，故有利于红细胞内外O2和CO2的交换。红细胞维持这种正常形态，可使其表面积(S)与体积(V)之比较大，有利于红细胞经历各种变形而不增加其表面积。正常红细胞的S/V高于1.5，如果S/V等于1.0则呈球形，S/V等于0.7则呈椭圆球形，后两者均使红细胞变形性下降［7］。

正常形态的红细胞具有良好的变形能力和抗剪切应力，其重要生理意义在于能适应大血管中快速血流的高剪切力作用，降低血液黏度;使直径为7～8 μm的红细胞通过直径仅有3 μm的毛细血管，为组织提供氧;促进氧在毛细血管水平的释放和被摄取［8］。经过血液回收机洗涤过后的红细胞呈肿胀状态，S/V变小，通过降低红细胞的变形性，进而影响氧转运和微循环灌注。

有研究表明手术创面的组织表面及空气与手术野的红细胞相接触会对红细胞产生破坏作用，而术中负压吸引收集可以通过应力损伤，造成红细胞的变形和破坏，使其结构和功能发生变化，如红细胞变形能力消失，甚至严重变形或破碎造成溶血，导致血液回输量减少。减少溶血的一种方式就是降低负压吸引的压力。Yazer等［9］证明了使用一种随着吸引头吸收空气的压力变化而自动调节负压吸引压力的装置可以减少溶血。Waters等［10］研究所示，降低负压吸引的压力可以减少用生理盐水稀释的血液60%的溶血。在离心杯内以5000 r/min速度高速离心旋转的回收红细胞会在外部应力的方向上拉长，过大的外部应力也可引起膜破坏而溶血，所以在负压吸引与高速离心的作用下衰老红细胞及细胞膜骨架结构有缺陷，形态及变形能力较差的红细胞容易发生破裂溶血而被清除。Cheng等［11］也认为回收后的红细胞更多的是年轻的正常红细胞。本研究结果红细胞畸形率小于本机构前期的研究结果［12］，可能原因是在制样过程中将红细胞用PBS反复清洗3次，将细胞碎片及变形较大的红细胞已经清除大部分，故畸形率较低。回输洗涤血1 h后，此时红细胞已经充分经过血液循环运行于全身，并发挥其携氧功能，一定程度上可以代表红细胞经过血液回收机后近期形态和功能的变化，但远期红细胞的功能维持及寿命的变化，可能需要术后更加长时间的观察，甚至将回输血进行针对性的标记，能够使后期的追踪更加准确。

虽然洗涤过程可除去红细胞碎片，但对那些功能已经发生障碍而尚能维持细胞完整形态的红细胞却不能完全除去，这部分红细胞可能在体内循环过程中受到一些剪切力的作用进一步变形甚至破碎形成红细胞碎片，释放出血红蛋白，这会危害组织的灌注。造成红细胞这种变形和破坏的主要因素，可能是自体血收集和回输过程中红细胞与管道和回收装置表面接触，血液回收机运转期间高速离心、泵管挤压、负压吸引、肝素抗凝、生理盐水冲洗、血气界面损伤及与高分子聚和物接触等因素所致，同时组织细胞损伤后释放的各种细胞因子，以及组织碎片、炎性介质、凝血因子、血小板和白细胞等因子在接触内皮下表面、气血界面、人工合成材料时也被激活，从而加重红细胞损害。这些因素作用于红细胞使其膜电压发生改变，Ca2+－ATPase活性降低，增加了细胞内Ca2+浓度。钙超载使红细胞膜丧失其柔韧应变的性质，变得僵硬，降低可塑性，使原双凹圆盘形红细胞变成有很多短的有规则突起的球状体－棘状细胞［13］。回收血使用生理盐水清洗后，回收血中各主要离子成份除钠离子、氯离子外均明显减少，钾、镁、钙等离子浓度均不足正常生理水平的50%，存在高钠、高氯、低钾情况。较多的Na+进入细胞内，超过了离子泵的代偿能力，导致细胞的肿胀，严重时发生红细胞破裂。上述红细胞变形能力和形态都会有明显改变，由此可见红细胞破坏和功能异常的关键在于细胞膜钙泵(Ca2+－ATPase)和钠泵(Na+－K+－ATPase)的运转异常，造成细胞内Na+升高及Ca2+超载，导致红细胞变形能力降低和血液流变学变化［14－15］。

AFM可以显示出红细胞膜表面是由大小不同的颗粒状物质的密集排列的凹凸表面，凸出的颗粒状物质直径大多小于50 nm，表面起伏只有几个纳米［16］，有研究认为颗粒状物质是各种膜外周蛋白，凹陷区域对应于细胞膜的脂质区［17］，这些膜蛋白颗粒分别作为易化扩散所需的载体和离子通道。本研究结果表明，回收未处理血红细胞膜表面颗粒分布紊乱，堆积型条索状隆起与凹陷，呈不典型的多聚体与单体杂乱分布的颗粒及孔洞形貌，是蛋白分子聚集体不能解聚的结果。Ra与Rq能够反映细胞膜表面的粗糙程度，洗涤前红细胞膜表面粗糙度高于其余时点的红细胞。红细胞膜为液态镶嵌模型，以磷脂双分子层为基质，其内镶嵌蛋白质分子。作为膜骨架结构的磷脂双分子层大部分以液态形式存在，球蛋白分子部分镶嵌于脂双层内，部分突出于脂双层表面，这些球蛋白分子可在脂双层上移动。蛋白分子通过疏水键与磷脂分子的亲水端结合，正常情况下蛋白分子不会发生聚集。血液回收时由于负压吸引、空吸及清洗等可改变回收血红细胞膜磷脂双分子骨架结构，使红细胞膜表面散在分布的蛋白分子发生聚集而形成较大的聚集体，出现以上红细胞膜分子结构中蛋白分子形貌学及红细胞膜表面粗糙度的变化。因此，回收血红细胞形态及超微结构发生明显改变，其形态学改变可影响红细胞的功能。细胞膜的稳定性在很大程度上依赖于蛋白质二级结构β螺旋的稳定。但是张东等［18］研究发现膜蛋白的二级结构不是造成回收血红细胞形态变化的主要原因，并且李西慧等［19］回收血的红细胞P50与正常值接近，认为对红细胞携氧能力无明显影响。

综上所述，自体血液回收导致患者红细胞AFM形貌及膜表面超微结构改变，其程度是否影响红细胞功能，以及回输后红细胞长期生存状况，还有待进一步探讨。

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