PI3K信号通路对哮喘小鼠调节性T细胞与Th17失衡的调控作用*

聂 颖，张维溪， 崇 蕾，王 婷， 李昌崇

(温州医学院附属育英儿童医院呼吸科，浙江 温州 325027)

T淋巴细胞在支气管哮喘(简称哮喘)气道炎症中发挥着核心作用。调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)和辅助性 T 细胞 17(T helper 17 cells，Th17)是来源于共同初始T细胞的两类辅助性T细胞，它们在分化和功能上均有相互抑制作用，促炎作用的Th17和抑炎作用的Treg细胞的失衡可以诱导哮喘等免疫性疾病的发生［1-2］。磷酯酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)是一类特异性催化磷酯醇(phosphatidylinositol，PI)3位羟基磷酸化，产生肌醇酯质产物的激酶。研究表明，PI3K参与哮喘的慢性气道炎症过程，在哮喘T细胞的活化、分化及细胞因子的产生中发挥着重要作用［3-4］。本实验通过建立BALB/c哮喘小鼠模型，体外培养T细胞，在细胞水平研究PI3K信号能否影响Treg/Th17失衡，并检测Treg/Th17分化的特异性转录因子Foxp3和RORγt，及特异性分泌因子白细胞介素(interleukin，IL)-10、IL-17的表达变化，探讨PI3K信号通路是否参与Treg/Th17失衡的调节。

材料和方法

1 主要试剂

鸡卵清蛋白(ovalbumin，OVA，Sigma)，植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA，Sigma);白细胞介素 2(Cinterleukin-2，IL-2)(上海华新生物技术有限公司);红细胞裂解液(Solarbio);RPMI-1640(Gibco);胎牛血清(杭州四季青公司);尼龙毛(Kisker);流式主要抗体:兔抗小鼠 CD4T细胞 -FITC(eBioscience);兔抗小鼠CD25T细胞-PE(eBioscience);IL-10 ELISA kit(R＆D Systems);IL-17 ELISA kit(R＆D Systems);Trizol(Invitrogen);逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(Fermentas);引物(上海基康公司合成);PI3K抑制剂LY294002(Sigma)。

2 动物

SPF级雄性BALB/c小鼠，4～6周，体重18～22 g，均购自上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于温州医学院SPF级实验动物中心。

3 哮喘动物模型的建立［5］

第1 d和第13 d经小鼠腹腔注射0.01%OVA/Al(OH)3混合液 0.1 mL［内含 OVA 10 μg 和Al(OH)3凝胶20 mg］致敏，第25 d至第32 d，每天将小鼠置于5 L密闭容器中，以1%OVA生理盐水溶液雾化激发，使小鼠暴露在OVA气雾中45 min，由喷射雾化器雾化。对照组小鼠，以生理盐水代替OVA。于末次激发后12 h内颈椎脱臼处死，取脾脏以备T细胞培养所用。

4 小鼠脾脏原代T细胞的分离及纯度和存活率的检测

无菌分离对照组和哮喘组BALB/c小鼠脾脏细胞，200目尼龙膜过滤。加入红细胞裂解液破红，PBS液洗涤2次，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬细胞，接种25 cm2培养瓶中培养2 h，除去贴壁细胞，调整细胞浓度为1×1011/L，加入尼龙毛柱中孵育60 min，除去与尼龙毛结合的B淋巴细胞，收集T淋巴细胞。采用流式细胞仪检验尼龙毛柱分选后T细胞的纯度。以0.4%台盼蓝对T细胞进行染色，观察细胞存活率，细胞存活率按下式计算:细胞存活率(%)=(染色阴性细胞数/细胞总数)×100%。

5 T细胞分组培养及干预

分别将对照组和哮喘组BALB/c小鼠的T淋巴细胞用含10%胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养基重悬，调整T细胞浓度(1×109/L)，分别铺于24孔，各为1 mL的细胞悬液，置于37℃、5%CO2孵箱中培养，按以下2组方案进行体外干预:对照组(A组)分为2个亚组:空白对照组 A1(对照组T淋巴细胞+PBS 5 μL)，PI3K抑制剂对照组A2(对照组T淋巴细胞+LY29400220 μmol/L);哮喘组(B组)继续分为4个亚组:哮喘组B1(哮喘组T淋巴细胞+PBS 5 μL)，5 μmol/L PI3K 抑制剂组 B2(哮喘组 T淋巴细胞 +LY2940025 μmol/L)，10 μmol/L PI3K抑制剂组B3(哮喘组T淋巴细胞+LY29400210 μmol/L)，20 μmol/L PI3K 抑制剂组B4(哮喘组T淋巴细胞 +LY29400220 μmol/L)，各组均加入 10 mg/L PHA和1×106U/L IL-2与细胞共培养6 h后，实验组各孔按上述分组加入干预剂，空白对照组加入等体积培养液，72 h后收获细胞。

6 Treg细胞比例的测定

收集 A1、A2、B1、B2、B3、B4 各组的细胞 1 ×106个，PBS洗涤1次，各管分别加入异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的CD4单克隆抗体20 μL，藻红蛋白(PE)标记的CD8单克隆抗体20 μL，避光孵育30 min，PBS洗2次。用流式细胞仪检测，每个样品测定10000个细胞，分析CD4和CD8的双阳性细胞数来确定各检测管中Treg细胞的表达比例。

7 各组T细胞上清液中IL－10和IL－17水平的检测

采用酶联免疫吸附反应(ELISA)法检测，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

8 各组T细胞中转录因子Foxp3和RORγt mRNA表达水平的检测

采用RT-PCR法检测。细胞匀浆并用Trizol法抽提RNA，继之根据试剂盒说明书进行逆转录反应，然后进行Foxp3、RORγt和β-actin产物扩增。PCR反应体系总体积25 μL，将反应物94℃预变性5 min后，94℃ 30 s，72℃ 1 min，循环32次，72℃ 10 min，见表1。用Gel-Pro Analyzer 4.0软件进行图像分析，计算目的产物荧光强度与β-actin产物荧光强度比值，作为Foxp3和RORγt mRNA的相对表达量。

表1 各对引物序列及扩增条件Table 1.Primer sequence and amplification conditions

9 统计学处理

应用SPSS 16.0统计软件进行分析。计量资料用均数±标准差()表示。采用单因素方差分析对各组进行分析，方差齐性者采用SNK法进行多重比较;方差不齐性者采用Dunnett's T3;相关性分析采用Spearman分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 小鼠脾脏细胞分选后T细胞的纯度和存活率

流式细胞仪分析结果显示，运用尼龙毛柱法分离后获得的T细胞，纯度达到(74.12±3.08)%，T细胞的存活率分别为(92.82±3.21)%，其中1次结果见图1。

多年来的退田还湖是值得肯定的。尽管如此，武昌湖周边圩区仍然是主要农耕区，提高圩区防洪能力是治水主要措施。为什么不能继续退田还湖？既然洪涝威胁性大，不如退地求湖，改变利用方式，以退为进。

Figure 1.Purity of T cells in splenocytes after separation.A:negative control;B:T cell ratio in splenocytes.图1 脾脏T细胞的纯度分析

2 各组中Treg细胞比例的变化

Treg细胞比例B1组［(3.57±0.35)%］显著低于A1组［(8.93±0.74)%］(P＜0.01);A2组［(14.73±1.75)%］显著高于A1组(P＜0.05);B3组［(5.63±0.46)%］和B4组［(7.08±0.40)%］显著高于 B1组(均 P＜0.01);B2组［(4.53±0.40)%］与 B1组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2、图2 ～4。

表2 各组T细胞中CD4+CD25+Treg细胞百分比Table 2.The percentage of CD4+CD25+Treg from each group(%..n=4)

表2 各组T细胞中CD4+CD25+Treg细胞百分比Table 2.The percentage of CD4+CD25+Treg from each group(%..n=4)

△P＜0.05，△△P ＜0.01 vs A1 group;★★P ＜0.01 vs B1 group;▲P ＜0.05 vs B3 group.A1:T cells from normal mice;A2:PI3K inhibitor-treated T cells from normal mice;B1:T cells from asthma mice;B2:5 μmol/L PI3K inhibitor-treated T cells from asthma group;B3:10 μmol/L PI3K inhibitor-treated T cells from asthma group;B4:20 μmol/L PI3K inhibitor-treated T cells from asthma group.

Group CD4+CD25+Treg A1 8.93±0.74 A2 14.73±1.75△B1 3.57 ±0.35△△B2 4.53±0.40 B3 5.63 ±0.46★★B4 7.08±0.40★★▲

Figure 2.Flow cytometric analysis of CD4+CD25+Treg from blank control group and asthma group.A:A1 group;B:B1 group.A1:T cells from normal mice;B1:T cells from normal mice.图2 空白对照组与哮喘组CD4+CD25+Treg细胞流式分析图

Figure 3.Flow cytometric analysis of CD4+CD25+Treg from blank control group and PI3K inhibitor control group.A:A1 group;B:A2 group.A1:T cells from normal mice;A2:PI3K inhibitor-treated T cells from normal mice.图3 空白对照组与PI3K抑制剂对照组CD4+CD25+Treg细胞流式分析图

3 各组中T细胞上清液中IL－10和IL－17的含量变化

Figure 4.Flow cytometric analysis of CD4+CD25+Treg from different groups.A:B1 group;B:B2 group;C:B3 group;D:B4 group;B1:T cells from asthma mice;B2:5 μmol/L PI3K inhibitor-treated T cells from asthma group;B3:10 μmol/L PI3K inhibitor-treated T cells from asthma group;B4:20 μmol/L PI3K inhibitortreated T cells from asthma group.图4 哮喘各干预组CD4+CD25+Treg细胞流式分析图

IL-17水平B1组［(51.01±3.33)ng/L］显著高于A1组［(19.65±1.74)ng/L］(P＜0.01);A2组［(12.29±1.34)ng/L］显著低于A1组(P＜0.01);B2组［(43.56±1.72)ng/L］、B3组［(32.36±1.78)ng/L］和 B4组［(26.92±1.38)ng/L］显著低于 B1组(均P＜0.01)，且呈药物浓度依赖性下降;与之相反，IL-10水平B1组［(12.46±1.65)ng/L］显著低于A1组［(57.47±1.72)ng/L］(P＜0.01);A2组［(71.36±5.42)ng/L］显著高于 A1组(P＜0.01);B2组［(21.23±3.86)ng/L］、B3组［(35.73±4.53)ng/L］和 B4组［(38.73±6.11)ng/L］显著高于 B1组(均P＜0.01);且呈药物浓度依赖性增高，见表3。

表3 各组T细胞上清液中IL－10和IL－17的水平Table 3.Levels of IL-10 and IL-17 in T cells from different groups(ng/L..n=8)

表3 各组T细胞上清液中IL－10和IL－17的水平Table 3.Levels of IL-10 and IL-17 in T cells from different groups(ng/L..n=8)

△△P ＜0.01 vs A group;★★P ＜0.01 vs B1 group;●●P ＜0.01 vs B2 group;▲▲P ＜0.01 vs B3 group.A1:T cells from normal mice;A2:PI3K inhibitor-treated T cells from normal mice;B1:T cells from asthma mice;B2:5 μmol/L PI3K inhibitor-treated T cells from asthma group;B3:10 μmol/L PI3K inhibitor-treated T cells from asthma group;B4:20 μmol/L PI3K inhibitor-treated T cells from asthma group.

A1 57.47±1.72 19.65±1.74 A2 71.36±5.42△△ 12.29±1.34△△B1 12.46±1.65△△ 51.01±3.33△△B2 21.23±3.86★★ 43.56±1.72★★B3 35.73±4.53★★●● 32.36±1.78★★●●B4 38.73±6.11★★●● 26.92±1.38★★●●▲▲

4 各组T细胞中转录因子Foxp3 mRNA和RORγt mRNA表达变化

RORγt mRNA表达 B1组(0.31±0.06)显著高于A1组(0.08±0.02)(P＜0.01);A2组(0.05±0.01)显著低于 A1组(P＜0.05);B2组(0.22±0.04)、B3组(0.15±0.04)和B4组(0.09±0.03)显著低于 B1组(分别为 P ＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)，且呈药物浓度依赖性降低。Foxp3 mRNA表达B1组(0.40±0.11)显著低于A1组(1.22±0.32)(P＜0.01);A2组(1.44±0.28)显著高于 A1组(P＜0.01);B2组(0.57±0.08)、B3组(0.82±0.22)和B4组(1.04±0.31)均显著高于B1组(分别为P＜0.05，P ＜0.01，P ＜0.01)，见图 5。

Figure 5.The expression of Foxp3，RORγt mRNA and RORγt/Foxp3 in different groups.M:DNA marker;A1:T cells from normal mice;A2:PI3K inhibitor-treated Tcells from normal mice;B1:T cells from asthma mice;B2:5 μmol/L PI3K inhibitor-treated T cells from asthma group;B3:10 μmol/L PI3K inhibitor-treated T cells from asthma group;B4:20 μmol/L PI3K inhibitortreated T cells from asthma group..n=8.△P＜0.05，△△P ＜0.01 A1 group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs B1 group.图5 各组T细胞组转录因子Foxp3和RORγt mRNA的表达

5 各组T细胞中转录因子RORγt mRNA/Foxp3 mRNA比值的变化

B1组RORγt mRNA/Foxp3 mRNA(0.83±0.26)显著高于A1组［(0.07±0.02)］(P＜0.01);A2组［(0.04±0.01)］显著低于A1组(P＜0.01);B2组(0.37±0.11)、B3组(0.18±0.05)和B4组(0.10±0.04)显著低于B1组(均P＜0.01)，且呈浓度依赖性降低，见图5。

6 RORγt mRNA/Foxp3 mRNA的比值与细胞因子IL－10和IL－17表达水平相关关系分析

RORγt mRNA/Foxp3 mRNA的比值与 Th17特异性细胞因子IL-17的分泌呈正相关(r=0.89，P＜0.01)，而与Treg特征性细胞因子IL-10的分泌呈负相关(r=-0.86，P ＜0.01)。

讨 论

T淋巴细胞是哮喘主要效应细胞之一。Th17和Treg细胞的生物学功能和分化过程相拮抗，促炎的Th17细胞和抑炎的Treg细胞相互制约以维持体内的免疫平衡。一旦Th17/Treg平衡失调，出现Th17优势反应，出现异常免疫反应导致哮喘等免疫性疾病的发生［1-2］。

Treg细胞是CD4+T细胞的一个重要亚型，通过细胞间的接触及分泌抑制性细胞因子(如IL-10或TGF-β等)来发挥免疫抑制作用［2］。有研究表明［6］，哮喘患者体内Treg细胞的数量和功能都出现下降，与本实验结果一致。同时我们的研究还表明，PI3K抑制剂LY294002在对照组和哮喘组内均介导了活化T细胞向Treg的分化，且在哮喘组内随着PI3K抑制浓度的增加Treg细胞逐渐增加，其结果提示PI3K信号通路通过对Treg细胞功能的调节而参与哮喘的发病过程，与 Liu 等［7］和 Patton 等［8］报道一致。

本研究发现，哮喘组较对照组脾脏T细胞中RORγt mRNA水平显著增高，伴随Th17的效应性细胞因子IL-17表达增高;而Foxp3 mRNA的表达明显降低，伴随Treg相关因子 IL-10表达下降，且RORγt/Foxp3比值增高，提示哮喘发生的可能机制与Th17/Treg失衡导致的免疫絮乱有关。

Sauer等［14］研究发现，PI3K 信号抑制剂通过调节TCR/CD28活化信号而参与Foxp3的诱导生成。我们在此基础上发现，PI3K信号不仅影响Foxp3的表达而且对RORγt的表达也具有显著作用。本实验应用PI3K抑制剂LY294002对哮喘T细胞进行干预发现，随着干预剂浓度的增加，Foxp3 mRNA的表达及IL-10水平逐渐增高;而RORγt mRNA及IL-17水平明显下降，且RORγt/Foxp3比例逐渐下降，各水平的变化呈浓度依赖性，且在对照组内变化与哮喘组一致，表明PI3K信号通路对哮喘Th17/Treg失衡起着调控作用。

总之，本实验证实哮喘小鼠T淋巴细胞中存在Th17/Treg失衡，而PI3K信号通路参与Th17/Treg失衡的调节，其机制可能是PI3K信号特异性抑制剂上调了特异性转录因子Foxp3的表达而间接抑制了RORγt的表达，使RORγt/Foxp3的表达优势发生改变，进而减轻Th17优势分化，使免疫失衡减轻，表现为其代表性细胞因子IL-10的升高和IL-17的下降。进一步深入研究PI3K信号通路与Th17/Treg平衡的调节机制，将为哮喘提供新的治疗靶点。

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