正常与退变椎间盘纤维环细胞相关基因的差异表达*

叶冬平，梁伟国，戴丽冰，沈 雁，陈鸿辉

(暨南大学医学院第四附属医院，广州市红十字会医院，广州市创伤外科研究所，广东 广州 510220)

椎间盘退变始于髓核，多数学者认为是多因素协同作用的结果。由于椎间盘在解剖学和生理学上具有孤立性和被包裹特征，为椎间盘退变的生物治疗(细胞因子、细胞移植、基因转染、基因治疗)提供有利的条件。椎间盘纤维环退变制机与髓核退变相似。由于髓核退变，椎间盘应力传递不均匀，致使纤维环应力过多聚集某一部位，加剧了纤维环的退变。本研究根据前期学者相关研究结果，采用实时荧光定量PCR(real－time qRT－PCR，SYBR Green)技术，检测17个与椎间盘退变相关的基因［包括合成代谢因子:骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein 7，BMP－7)、骨形态发生蛋白14(bone morphogenetic protein 14，BMP －14)、骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4，BMP －4)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、血小板源性生长因子(platelet－ derived growth factor，PDGF)、骨形态发生蛋白 2(bone morphogenetic protein 2，BMP －2)、转化生长因子 β(transforming growth factor β，TGF－β)、胰岛素样生长因子 1(insulin－like growth factor 1，IGF－1)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、金属蛋白酶1组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase－1，TIMP－1)和 SOX9转录因子(sex determining region Y－box 9，SOX9);分解代谢因子:基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinases 3，MMP3)、白细胞介素－1(interleukin－1，IL－1)和诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS);细胞外基质:I型胶原α1链(collagen type I，alpha 1 chain，COL1A1)、II型胶原 α1 链(collagen type II，alpha 1 chain，COL2A1)和聚蛋白多糖(aggrecan)］，研究其在人正常和退变椎间盘纤维环细胞中表达量的差异，以期探讨这些相关基因与椎间盘退变的关系，筛选明显差异基因作为退变纤维环细胞体外刺激因子，为生物治疗椎间盘退变奠定基础。

材料和方法

1 材料

1.1 细胞 人正常髓核细胞，细胞原代培养标本均源自本院因外伤致脊柱爆裂性骨折手术的患者，共3例，腰1～2椎间盘1例，腰3～4椎间盘2例，手术均为前侧入路减压，较完整地取出椎间盘，其中平均年龄32岁。根据Gries等［1］评分标准，均未见退变。

人退变髓核细胞，细胞原代培养标本均源自本院因腰椎退行性变手术的患者，共3例，其中腰3～4椎间盘1例，腰4～5椎间盘2例，平均年龄75岁。根据 Gries等［1］评分标准及磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)，均为重度退变。本研究均征得本人及家属的知情同意，且通过了广州市红十字会医院伦理委员会的批准。

1.2 试剂 高糖DMEM培养基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，青－链霉素溶液(吉诺生物医药技术有限公司)，0.25%Trypsin和0.02%EDTA溶液(吉诺生物医药技术有限公司)，Trizol试剂(Gibco)，0.01 mol/L PBS液(Gibco)，Ⅱ型胶原酶(Sigma)，逆转录试剂盒(Promega)、25 cm2细胞培养瓶(Corning)。

1.3 仪器 CO2培养箱(Thermo 8000DH)，81－2型恒温磁力振动搅拌机(上海司乐仪器厂)，倒置光学相差显微镜(Nikon ECLIPSE Ti－U)，自动平衡离心机(LDZ4 －0.8)，超净工作台(SW－CJ0－ICU)，ABI 3900台式高通量DNA合成仪(ABI)，科大创新 HC－3018R高速冷冻离心机，ABI 9700 PCR仪(ABI)，ABI 7500全自动荧光定量PCR仪(ABI)

2 方法

2.1 细胞分离、培养及传代 手术均从后侧入路，能完整取出椎间盘。分离纤维环组织与髓核组织时，依靠肉眼、手感等进行区分。纤维环组织呈白色略硬韧性软环状，用眼科剪充满阻力，韧性较高。分离清楚后，用含双抗(青－链霉素)的生理盐水浸泡椎间盘纤维环组织10 min，双抗生理盐水浸泡冲洗3～4次。用眼科剪将纤维环组织剪成大小为1 mm×1 mm×1 mm大小，放入盛有10 mL 0.2%Ⅱ型胶原酶的100 mL烧杯中，37℃磁力搅拌器搅拌约60 min。待组织完全溶解后，200目的滤网过滤，1000 r/min离心10 min，弃去上液，用含10%胎牛血清的DMEM培养基1～2 mL轻轻吹散细胞，吸至25 cm2培养瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基6～8 mL，静置于37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中培养3 d。3 d后倒置显微镜观察细胞贴壁生长情况，隔天换液。

当细胞接近90%汇合时进行传代。弃掉培养液，用0.01 mol/L PBS洗涤细胞2次，弃掉液体。沿瓶壁加入2 mL 0.25%Trypsin+0.02%EDTA溶液，轻晃动培养瓶，镜下观察消化情况。镜下见细胞皱缩、间隙加大、大部份细胞变圆漂浮时立即用含血清的培养液3 mL终止消化;用吸管轻轻吹打细胞数次制成细胞悬液。接种:细胞悬液1000 r/min离心5 min，弃上清，DMEM培养液混悬细胞后按1∶2接种。培养条件同原代培养。

2.2 引物探针设计合成 GenBank上查找目的基因mRNA序列，在CDS区设计特异性引物，Primer Express 2.0软件设计引物探针，中山大学达安基因股份公司合成，见表1。

2.3 细胞总RNA的提取 105个细胞置于1.5 mL Eppendorf管，加Trizol 1 mL。加入氯仿0.2 mL，盖紧盖子，用力摇动15 s，15～30℃孵育2～3 min，4℃ 12000 r/min离心15 min，取上清液至新的1.5 mL Eppendorf管。加与上清液等体积的异丙醇，15～30℃孵育样品10 min，4℃ 12000 r/min离心10 min，弃上清液，75%乙醇(含DEPC水)洗涤沉淀1次(至少1 mL 75%乙醇/mL Trizol)，4℃ 7500 r/min离心5 min，弃乙醇，空气或真空干燥5～10 min(不要完全干燥)，加DEPC处理水溶解RNA，－80℃保存备用。若长期保存，加入2.5倍体积乙醇，置－80℃保存。

2.4 逆转录反应 取4 μL RNA模板做逆转录反应，仪器为ABI 9700仪(ABI)，反应体系如下:5×逆转录 buffer 4μL，下游引物 R(10 μmol/L)0.4 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL，MMLV(2 ×108U/L)1 μL，DEPC 水 10.1 μL，RNA 模板 4 μL，总体积 20 μL。

2.4.1 逆转录 buffer成分 50 mmol/L Tris－HCl(pH8.0)，50 mmol/L KCl，4 mmol/L MgCl2，10 mmol/L DTT。

2.4.2 反应条件 37℃ 1 h，然后95℃ 3 min。

2.5 荧光定量PCR反应

2.5.1 阳性标准品及其梯度的制备 标准曲线定量法。h

表1 引物序列和产物长度Table 1.The primers sequences and product pength

2.5.2 阳性标准品的制备 预实验PCR扩增的阳性产物经过2%低熔点琼脂糖凝胶电泳(含溴化乙啶，用TAE缓冲液配制)，在长波紫外下，割下目的条带。用回收试剂盒(QIA-quick Gel Extraction Kit)回收纯化。测定 A260/280＞ 1.8，表明纯度合格。用A260测定值和片段长度数据换算出浓度(106copies/L)，即为阳性标准品。

2.5.3 阳性标准品梯度的制备 取阳性标准品5 μL按10倍稀释(加水45 μL并充分混匀)，依次稀释下去，制备成阳性定量标准品梯度，倍比稀释一定要准确，否则影响定量结果。每次上机必须新鲜配制阳性定量标准品梯度，正式上机时以包含所有样本的5个梯度上机即可。

2.5.4 阴性质控标准品 采用灭菌双蒸水。

2.5.5 待测样本和阳性标准品的反应体系 5×染料PCR buffer 10 μL，上游引物 F(10 μmol/L)1 μL，下游引物 R(10 μmol/L)1 μL，dNTPs(10 mmol/L)1 μL，Taq 酶(3 ×106U/L)1 μL，cDNA 或阳性标准品 5 μL，ddH2O 31 μL，总体积 50 μL。

2.5.6 PCR buffer成分 10 mmol/L Tris－ HCl(pH8.0)，50 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2。

2.5.7 反应条件 93℃ 3 min，然后93 ℃ 30 s，55℃ 45 s，共40循环。

3 统计学处理

结 果

1 人正常和退变纤维环细胞光学形态

人正常纤维环细胞与退变纤维环细胞表形没有明显差异，细胞呈短梭形和长梭形，有明显的极性;正常纤维环细胞较退变纤维环细胞胞质饱满，核仁稍大，以短梭形居多;退变纤维环细胞较正常纤维环细胞生长快，易培养，以长梭形居多，近似成纤维细胞，见图1、2。

Figure 1.Human normal AF cells(×200).图1 人正常纤维环细胞

Figure 2.Human degenerative AF cells(×200).图2 人退变纤维环细胞

2 荧光定量PCR结果

与正常纤维环细胞相比，退变纤维环细胞TGF－β、IL－1、PDGF和IGF－1 mRNA表达量降低(P ＜0.01，P ＜0.05);bFGF、TIMP－1、COL1A1和 BMP－14 mRNA 表达量升高(P＜0.01);正常纤维环细胞 aggrecan和BMP－2 mRNA高表达，退变纤维环细胞两者表达阴性;COL2A1、iNOS和MMP3在正常纤维环细胞mRNA有表达，在退变纤维环细胞表达阴性;EGF在正常纤维环细胞mRNA表达阴性，在退变纤维环细胞有表达。SOX9、BMP－4和BMP－7在正常和退变纤维环细胞mRNA表达均为阴性，见表2。

表2 正常纤维环细胞与退变纤维环细胞椎间盘退变相关基因mRNA的表达Table 2.The mRNA expression of intervertebral disc degeneration－related genes in normal AF cells and degenerative AF cells(.n=3)

表2 正常纤维环细胞与退变纤维环细胞椎间盘退变相关基因mRNA的表达Table 2.The mRNA expression of intervertebral disc degeneration－related genes in normal AF cells and degenerative AF cells(.n=3)

*P ＜0.05 ，＊＊P ＜0.01 vs normal AF cells.

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讨 论

I型胶原、II型胶原、糖胺多糖基因分析用于衡量椎间盘退变过程中细胞外基质的特征性改变。糖胺多糖和II型胶原mRNA在未退变的髓核细胞中含量丰富，在退变的髓核细胞中下降明显，I型胶原则相反。这3种基因表达量的改变提示髓核细胞表型从类软骨细胞转化为成纤维细胞。

人椎间盘疾病不仅与其主要基质——蛋白多糖和胶原对应的基因改变相关，而且与影响椎间盘基质的细胞因子基因有关［2－3］。编码髓核细胞合成代谢因子的 BMP －2、4、7、14、TGF － β、IGF －1，EGF、PDGF、bFGF 和 SOX9 基因在退变髓核细胞中下降明显。在其它肌肉骨骼组织中，这些基因被证实是创伤过程中促进组织愈合、逆转退变过程的始动基因。炎症调节因子如IL－1等可以提高滑膜和软骨BMP－2、BMP－7 mRNA和蛋白的表达。这些基因在退变椎间盘髓核细胞中表达量明显下降的机制尚未明确，但因为椎间盘无血管支配、细胞数目较少、免疫豁免等特征，生长因子基因的下调可能是椎间盘细胞特有的现象。这一特有现象可能是椎间盘细胞退变的一种机制。椎间盘细胞合成代谢因子基因的明显下降，提示这些生长因子可以作为基因治疗退变椎间盘的候选因子。

生长因子是目前研究最为深入和广泛的治疗椎间盘退变的蛋白质，它是通过增加细胞活性、提高细胞增殖效率、上调合成代谢通路等增加蛋白多糖含量。在众多生长因子中，IGF、FGF、EGF、PDGF等被证实可以有效提高髓核细胞的增殖水平［4］。Gruber等［5］报道，IGF －1 和 FGF 能够防止椎间盘细胞凋亡。BMPs家族、TGF－β、生长分化因子5不仅能够促进细胞的增殖，而且可以促进细胞外基质糖胺多糖和Ⅱ型胶原的合成，保持了类软骨细胞的表形特征。其它生长因子，如Nell－1(与BMPs家族类似，具有骨形成诱导作用)同样具有潜在的逆转椎间盘退变的作用［6］。

1991年Thompson等［4］首先报道体外培养的髓核细胞加入外源性生长因子可以促进细胞外基质蛋白多糖的合成。很多研究已经证实TGF－β1能够促进髓核细胞外基质糖胺多糖和Ⅱ型胶原的表达。Chen等［7］指出TGF－β1可以持续刺激人髓核细胞增殖和蛋白多糖合成。Risbud等［8］最近报道TGF－β3可以使髓核细胞和纤维环细胞增殖、增加蛋白多糖聚集，效率远比TGF－β1高。将外源性细胞内调节因子如:LMP－1、SOX9基因转染入髓核细胞，可以明显地增加髓核细胞外基质的糖胺多糖、Ⅱ型胶原的表达。Zhang等［9］以重组腺病毒为载体比较 BMP 家族各成员(2、3、4、5、7、8、10、11、12、13、14、15)、SOX9 基因等对牛髓核细胞外基质合成的影响，发现6 d后BMP－2和BMP－7基因治疗组，蛋白多糖的生成明显高于其它基因治疗组。BMP－4和BMP－14基因治疗组明显地增加了胶原的合成。BMP－2基因治疗组对髓核细胞的增殖效果明显高于其它组。Zhang等［10］同时也得出转染BMP家族的软骨细胞与髓核细胞共培养，可以使髓核细胞分泌更多的蛋白多糖。

TIMP－1是一种细胞内基质金属蛋白酶抑制因子。它能特异性与MMPs形成非共价键结合，阻止MMPs降解细胞外基质。细胞外基质各种分解酶与其抑制物的失衡可能是椎间盘退变的关键因素。TIMP－1分子与IGF－1、TGF－β、IL－1β等的关系已经有部分学者进行相关研究［11］。Gunther等［12］显示TGF－β可以提高TIMP－1在人关节软骨细胞的表达。因此，有学者认为TIMP－1受到生物力学应力的影响大于细胞因子的影响。Pufe等［13］在成人椎间盘细胞中增加应力，明显抑制了TIMP－1的生成量。因为TIMP－1含量在椎间盘退变过程中明显降低，它有可能是维持椎间盘代谢正平衡的重要调节因子，对基因转染治疗椎间盘退变带来一个新的思路。本实验示退变纤维环TGF－β、IL－1 mRNA低表达，而TIMP－1 mRNA高表达，其原因有待研究。

SOX9是Ⅱ型胶原合成过程中重要的转录因子，其在软骨发育成熟过程中对Ⅱ型胶原基因COL2A1表达的增强和促使Ⅱ型胶原合成增加有明确的作用，SOX9基因作为一种翻译因子基因，受到国内外众多学者的关注和研究。退变的人椎间盘细胞中转染腺病毒介导的SOX9基因，证实其可以使椎间盘细胞增殖、II型胶原及蛋白聚糖的合成得到增加［14］。进一步研究发现，大多数生长刺激因子都是通过提高SOX9 mRNA的表达，从而引起COL2A1表达的增加，相应地增加II型胶原及蛋白聚糖的合成［15］。但在本实验SOX9在正常和退变纤维环细胞mRNA表达阴性，原因有待进一步研究。

张小卫等［16］通过基因芯片分析人正常和退变颈椎间盘组织基因表达谱的差异，发现多种基因表达异常与颈椎间盘退变相关，有570个基因发生差异表达，其中上调550个，下调20个。我们选择了17个与椎间盘退变相关基因，采用实时荧光定量PCR技术进一步验证。本研究表明:椎间盘纤维环退变与 TGF－β、IL－1、PDGF、IGF－1、aggrecan和 BMP－2 mRNA 低表达，bFGF、TIMP －1、BMP －14、COL1A1 mRNA 高表达相关;退变纤维环COL1A1 mRNA高表达与西安大学医学院对退变颈椎间盘研究结果一致，提示退变纤维环细胞COL1A1蛋白表达可能增高。根据本研究结果BMP－2、TGF－β、PDGF和IGF－1可作为退变纤维环细胞体外刺激因子备选，逆转椎间盘退变研究;bFGF、TIMP－1和BMP－14 mRNA高表达，可能是椎间盘纤维环细胞退变的标志物。BMP－2 mRNA在正常纤维环细胞高表达，而退变纤维环细胞mRNA表达阴性;bFGF mRNA在退变纤维环细胞表达明显高于正常纤维环细胞，因此本课题下一步拟用BMP－2和bFGF刺激退变椎间盘纤维环细胞，研究比较这两种极端表达因子对纤维环细胞生物学特性的影响。

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