红曲E-70及洛伐他汀对乳腺癌细胞MCF-7的增殖影响

冯荣洁 吴 铁

广东医学院药理教研室，广东 湛江 524023

红曲是红曲霉菌（monascus purpureus）经液体深层发酵精致而成的一种纯天然、有益于人体健康的食品添加剂，也被称为天然他汀，是降血脂的天然保健品，洛伐他汀被认为是其主要的药效成分。近年来国内外学者发现，洛伐他汀对乳腺癌有明显地抑制肿瘤细胞增殖的作用[1-4]。但天然红曲是否也有抗癌作用，至今未有报道，本实验观察天然红曲70%乙醇提取物（红曲E-70）对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖影响，探讨该成分是否有抑制乳腺癌的作用，同时，与洛伐它汀进行比较，了解红曲的其他天然成分对洛伐他汀的抗癌作用是否有协同作用，为天然红曲作为预防乳腺癌的保健食品提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物与癌细胞

①红曲E-70：天然红曲（东莞市天益生物工程有限公司提供）70%乙醇提取工艺为天然红曲30 g，70%乙醇浸泡12 h，8倍量70%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，回收乙醇，减压干燥后得70%乙醇提取物；②洛伐他汀：中国药品生物制品检定所；③人乳腺癌细胞MCF-7：来自ATCC，10%FBS RPMI 1640培养，隔天换液，3～5 d传代。

1.2 红曲E-70水溶液中的洛伐他汀含量测定

1.2.1 供试液的制备 红曲E-70 11.87 mg，用蒸馏水溶解定容至5 mL，过滤后待用。

1.2.2 标准液的制备 精密称取洛伐他汀对照品0.40 mg，甲醇溶解定容至5 mL，超声；以此浓度用甲醇稀释成以下浓度，并定容至 5 mL，使终浓度为 0.005、0.01、0.02、0.04 mg/mL，过滤后待用。

1.2.3 色谱条件 流动相： 甲醇∶0.002%磷酸溶液 （75∶25）；流速：1 mL/min；色谱柱为 kromasil C-18；柱温：30℃；检测波长：238 nm；进样量：10 μL。

1.2.4 每毫升红曲E-70提取液中洛伐他汀含量的计算 用标准曲线法求出红曲E-70水溶液里洛伐他汀的含量。

1.3 癌细胞增殖抑制实验（MTT法）

将处于对数生长期的MCF-7细胞用胰蛋白酶消化后，以10%FBS RPMI 1640培养液制成5×104个/mL的细胞悬液，然后以每孔100 μL接种到96孔板上，在37℃，5%CO2孵箱中培养24 h，然后换成无血清培养基培养24 h，之后再更换培养液；红曲E-70组加入不同浓度的红曲E-70 100 μL，终浓度分别为： 1、10、50、100、150 μg/mL；洛伐他汀组加入洛伐他汀对照品，其加入量为换算后红曲E-70中洛伐他汀含量的相同剂量，用无水乙醇溶解 （无水乙醇最大体积为0.0078%，本实验已经证明此体积含量对MCF-7的增殖无影响），即终浓度为 0.001、0.01、0.05、0.1、0.15 μg/mL；对照组加入等体积的培养液；空白对照组不加细胞，加入等体积的培养液，每一样品均设4个平行孔。继续培养24、48及72 h后，吸弃原培养液，每孔以PBS洗1次，加入100 μL新的无血清培养基和10 μL MTT溶液（浓度为5 mg/mL），轻振培养板。放回培养箱内再孵育4 h后，吸弃上清液，每孔中加二甲基亚砜100 μL，置于暗处振荡10 min，酶标仪检测各孔吸光度（OD值），测定波长为490 nm。存活率计算公式为：存活率（%）=[（实验组 OD值-空白对照组 OD值）/（对照组 OD值-空白对照组OD值）]×100%。本实验重复3次。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（）表示，组间比较采用方差分析；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红曲E-70中洛伐他汀含量测定结果

以进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明：在0.005～0.08 mg/mL范围内有良好的线性关系，回归方程为 y=612 53x-4.049 3，R2=0.999 9（图 1），红曲E-70水溶液的峰面积为149.428 18，代入回归方程后得其浓度为0.002 50 mg/mL。红曲E-70的浓度为2.37 mg/mL，据此求出每1毫克红曲E-70中含有洛伐他汀0.001 mg。由图2可知，洛伐他汀的出峰时间在12 min左右，图3在12 min左右也有洛伐他汀峰，证明红曲E-70中含有洛伐他汀。

图1 洛伐他汀标准曲线

图2 洛伐他汀对照品HPLC

图3 红曲乙醇提取物HPLC

2.2 细胞形态学观察药物对MCF-7细胞的抑制作用

倒置显微镜下观察经过不同处理组中的MCF-7细胞形态变化（图4A～G）。对照组细胞生长状况良好，透明度大，折光性强，细胞形态呈多边形且连成片；经不同浓度红曲E-70处理后的MCF-7，生长状况差，折光性弱，贴壁细胞皱缩，变圆，随着功能红曲乙醇提取物浓度的增加，皱缩，变圆的程度增加，有些甚至脱落，漂浮；而洛伐他汀只有0.15 μg/mL组有部分细胞皱缩，变圆。

图4 倒置显微镜观察MCF-7细胞形态（10×10）

2.3 红曲E-70对MCF-7增殖率的影响

与对照组相比，红曲E-70在1～150 μg/mL对MCF-7均有抑制作用，50～150 μg/mL对MCF-7的抑制作用尤其明显（P<0.05或P<0.01）；而经换算后加入相应量的洛伐他汀组，其对MCF-7的抑制作用不明显，与对照组相比，只有0.15 μg/mL浓度组对MCF-7的抑制作用有显著差异（P<0.05）。见表1。

3 讨论

3.1 红曲E-70对人乳腺癌MCF-7的抑制作用

红曲E-70在1～150 μg/mL浓度范围内对MCF-7均有抑制作用，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），随着浓度增大，其抑制作用更加明显，尤其在50～150μg/mL浓度范围内（P<0.01）。细胞形态观察也表明，随着红曲E-70浓度的增加，细胞皱缩、变圆的程度增加，甚至出现细胞脱落，漂浮。有研究报道，红曲黄色素Ankaflavin对人肝癌细胞Hep G2和人肺癌细胞A549具有诱导凋亡作用[5]。也有学者报道，红曲橙色素OR能有效地抑制人胃癌细胞AGS的增殖，与常用的腺癌临床治疗药物紫杉醇相比，橙色素OR对人胃癌细胞株AGS生长的抑制效果更为显著，且对人正常胃上皮细胞（GES-1）的毒性作用较小[6]。丁红梅[7]观察到红曲多糖对小鼠S180肉瘤生长有明显的抑制作用，且高剂量组免疫器官脾脏质量显著增加，表明红曲多糖有抗肿瘤作用。但红曲对人乳腺癌MCF-7的抑制作用至今没有报道，笔者研究证明，红曲E-70对乳腺癌细胞有明显的抑制作用。这种作用可能与其含有丰富的红曲橙色素、红色素、黄色素、多糖等成分有关，具体抑制癌细胞增殖的成分，还有待进一步深入研究。

表1 红曲E-70及洛伐他汀对MCF-7细胞增殖的影响（，n=4）

表1 红曲E-70及洛伐他汀对MCF-7细胞增殖的影响（，n=4）

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

组别 浓度（μg/mL）培养时间24 h 48 h 72 h对照组红曲E-70组1洛伐他汀组10 50 100 150 0.001 0.01 0.05 0.1 0.15 0.260±0.011 0.240±0.012*0.238±0.014*0.213±0.019**0.210±0.010**0.194±0.013**0.252±0.005 0.253±0.007 0.249±0.008 0.241±0.011 0.237±0.012*0.256±0.010 0.230±0.012*0.235±0.011*0.225±0.012**0.207±0.011**0.186±0.008**0.256±0.008 0.256±0.014 0.253±0.006 0.246±0.010 0.238±0.011*0.255±0.010 0.227±0.012*0.218±0.012**0.199±0.011**0.185±0.008**0.175±0.010**0.255±0.015 0.247±0.012 0.245±0.021 0.239±0.019 0.227±0.016*

3.2 红曲E-70对人乳腺癌MCF-7的抑制作用优于洛伐他汀

本实验显示，红曲E-70抑制MCF-7增殖（P<0.05或P<0.01）。通过高效液相检测红曲E-70中的洛伐他汀含量，经换算后，红曲E-70最小有效量中，1 mL含有洛伐他汀0.001 μg，即洛伐他汀含量是红曲E-70的千分之一。将红曲E-70中对应量的洛伐他汀加入MCF-7中进行培养，结果显示，红曲中同剂量的洛伐他汀对MCF-7的增殖抑制作用不明显，只有0.15 μg/mL组与对照组有显著性差异（P<0.05）。已经有报道，红曲中主要成分之一洛伐他汀有抗肿瘤作用[8]。研究者分别以 4、8、16 μmol/L洛伐他汀处理 MCF-7细胞24～72 h后，流式细胞仪检测细胞周期的时相分布及细胞凋亡率，硝基蓝四氮唑（NBT）还原实验鉴定细胞分化；研究结果提示，洛伐他汀对MCF-7细胞的影响主要是抑制细胞增殖和促进细胞分化，而诱导MCF-7细胞凋亡的作用不明显，同时洛伐他汀还能将该细胞阻滞于G0/G1期，作用存在浓度-效应和时间-效应依赖关系。上述研究最小有效量4 μmol/L是笔者实验中洛伐他汀最大剂量0.15 μg/mL的11倍左右，由此推测，红曲E-70抑制MCF-7细胞增殖可能不是主要通过洛伐他汀起作用。 还有研究者以 5.93、20、40、80 μmol/mL洛伐他汀（LV）和 20、50、75、100、150、200、250、300 μg/mL 红曲提取物（RYR）分别作用于HCT-116和 HT-29；结果发现，LV抑制HCT-116和 HT-29的细胞增殖（P<0.001）并诱导凋亡（P<0.05），RYR 抑制 HCT-116 和 HT-29 增殖（P<0.001），而且作用于HCT-116时能诱导凋亡（P<0.05）；在LV组加入甲羟戊酸（MV），改变其抑制HCT-116和 HT-29增殖的作用，而RYR组加入MV并没有改变其抑制细胞增殖作用，而不含莫那可林K（MK）的红曲提取物组也没有改变LV介导的抑制细胞增殖作用[9]。以上结果提示，红曲提取物的组成包括洛伐他汀、色素和影响其作用的多种成分，作用于癌细胞内的信号通路可能与纯品洛伐他汀不同。在笔者实验中，洛伐他汀组的有效剂量0.15 μg/mL是5.93 μmol/L的7%，而红曲E-70的最小有效剂量（1 μg/mL）是以上研究RYR最小有效量（20 μg/mL）的 1/20。 洛伐他汀在 0.001～0.150 μg/mL浓度范围内其抑制癌细胞增殖作用明显没有红曲E-70（1～150 μg/mL）的作用好，与文献报道相似，提示红曲E-70和洛伐他汀抑制癌细胞增殖的信号通路不同。红曲E-70里可能含有多种抗肿瘤活性物质活性成分，有可能可以通过不同的信号通路抑制癌细胞增殖，诱导其凋亡，但具体是哪些成分起抑制作用和相关信号通路抑制癌细胞增殖还有待进一步研究。

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