熊胆粉微生物限度检查方法学验证

杨务彬 李元宏 兰 鸿

湖北医药学院附属太和医院药学部，湖北 十堰 442000

熊胆粉为熊科动物黑熊Selenaretos thibetanus Cuvier经胆囊手术引流胆汁而得的干燥品，收载于国家药品标准《新药转正标准》第11册[1]，本品有一定的抑菌作用[2]，但其微生物限度检查一直采用常规方法检验，根据《中国药典》2010年版的要求，对原用的常规方法进行验证[3]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LDZX-40BI立式自动电热压力蒸气灭菌器（上海申安医疗器械厂），DNP-9162型电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司），HH B11 600型电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂），LRH-150B生化培养箱（广东医疗器械厂），超净台（苏净集团安泰公司）。

1.2 培养基

营养肉汤培养基，改良马丁培养基，营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，胆盐乳糖培养基，甘露醇氯化钠琼脂培养基，溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB），四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB），胆盐硫乳琼脂培养基（DHL），均购自中国药品生物制品检定所。

1.3 阳性对照菌

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，大肠埃希菌[CMCC（B）44102]，枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]，铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]，乙型副伤寒沙门菌[CMCC（B）50094]，白色念珠菌[CMCC（F）98001]，黑曲霉菌[CMCC（F）98003]，均购自四川省食品药品检验所。

1.4 供试品

熊胆粉（购自四川省新鹿药业有限公司，批号：091203、091204、091205）。

2 方法与结果

2.1 供试液的制备

2.1.1 供试液制备方法1

取供试品10 g，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，混匀，作为 1∶10 供试液。

2.1.2 供试液制备方法2

取1∶10供试液25 mL加pH 7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至50 mL，混匀，作为1∶20供试液。

2.2 阳性对照菌液的制备

将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种于营养肉汤培养基中，30～35℃培养18 h，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释制成每1 mL中含菌数为50～100 cfu的菌悬液，备用；接种白色念珠菌的新鲜培养物于改良马丁琼脂培养基中，25℃培养24 h，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释制成每1 mL中含菌数为50～100 cfu的菌悬液，备用；接种黑曲霉的新鲜培养物于改良马丁琼脂斜面培养基上，25℃培养5 d，加入5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释制成每1 mL含孢子数50～100 cfu的孢子悬液，备用。

2.3 检查方法验证[4]

2.3.1 试验组

2.3.1.1 常规法 分别取1∶10供试液1 mL和试验菌株的菌悬液 1 mL（50～100 cfu）入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养，观察并计数。

2.3.1.2 培养基稀释法1 分别取1∶10供试液0.2、0.1 mL（0.2、0.1 mL/皿）和试验菌株的菌悬液 1 mL（50～100 cfu）入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养，观察并计数。

2.3.1.3 培养基稀释法2 分别取1∶20供试液0.1 mL（0.1 mL/皿）和试验菌株的菌悬液 1 mL（50～100 cfu）入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养，观察并计数。

2.3.2 菌液组

分别取1 mL试验菌株（50～100 cfu）入平皿中，立即倾注琼脂培养基混匀，待凝固后，置规定温度培养，观察并计数，每种菌各制备2个皿。

2.3.3 供试液本底测定

2.3.3.1 常规法 分别取1∶10供试液1 mL入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养，观察并计数。

2.3.3.2 培养基稀释法1 分别取1∶10供试液0.2、0.1 mL入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养，观察并计数。

2.3.3.3 培养基稀释法2 分别取1∶20供试液0.1 mL入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养，观察并计数。

2.4 回收率测定

2.4.1 常规法测定

常规法测定回收率，白色念珠菌、黑曲霉菌、大肠埃希菌回收率均高于70%，可采用常规法进行霉菌、酵母菌计数；金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收率低于70%，说明本品对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑菌作用，细菌检查不能采用常规法。见表1。

2.4.2 培养基稀释法测定

2.4.2.1 培养基稀释法（1∶10供试液，0.2 mL/皿）测定回收率 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌回收率高于70%，枯草芽孢杆菌回收率低于70%；采用培养基稀释法（1∶10供试液，0.2 mL/皿）不可消除本品对枯草芽孢杆菌的抑菌作用。见表1。

2.4.2.2 培养基稀释法（1∶10供试液，0.1 mL/皿）测定回收率 枯草芽孢杆菌回收率低于70%；采用培养基稀释法（用1∶10供试液，0.1 mL/皿）不可消除本品对枯草芽孢杆菌的抑菌作用。

2.4.2.3 培养基稀释法（1∶20供试液，0.1 mL/皿）测定回收率 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌3次独立试验回收率均高于70%；采用培养基稀释法（1∶20供试液，0.1 mL/皿）可消除本品对枯草芽孢杆菌的抑菌作用。见表1。

2.5 控制菌检查法验证[5-6]

2.5.1 大肠埃希菌检查法

分别取1∶10供试液10 mL，加入3瓶100 mL胆盐乳糖培养基中，其中一瓶加入1 mL大肠埃希菌菌液（50～100个/mL）作为试验组，一瓶加入1mL金黄色葡萄球菌菌液（50～100个/mL）作为阴性菌对照组；另取1瓶100 mL胆盐乳糖培养基，加入1 mL大肠埃希菌菌液（50～100个/mL）作为大肠埃希菌阳性对照组。按大肠埃希菌检查法检验，结果见表2。

表1 消除供试品抑菌活性回收率试验

表2 大肠埃希菌检查结果

由表2可知，阴性菌对照组未检出大肠埃希菌，试验组检出大肠埃希菌。可采用常规法进行本品的大肠埃希菌检查。

2.5.2 金黄色葡萄球菌检查法

分别取 1∶10供试液 10 mL，加入 3瓶 100 mL营养肉汤培养基中，其中一瓶加入1 mL金黄色葡萄球菌菌液（50～100个/mL）作为试验组，一瓶加入1 mL大肠埃希菌菌液（50～100个/mL）作为阴性菌对照组；另取100 mL营养肉汤培养基，加入1 mL金黄色葡萄球菌菌液（50～100个/mL）作为金黄色葡萄球菌阳性对照组。按金黄色葡萄球菌检查法检验，结果见表3。

表3 金黄色葡萄球菌检查结果

由表3可知，阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌，试验组检出金黄色葡萄球菌。可采用常规法进行本品的金黄色葡萄球菌检查。

2.5.3 铜绿假单胞菌检查法

分别取 1∶10供试液 10 mL，加入 3瓶 100 mL胆盐乳糖培养基中，其中一瓶加入1 mL铜绿假单胞菌菌液（50～100个/mL）作为试验组，一瓶加入1 mL大肠埃希菌菌液（50～100个/mL）作为阴性菌对照组；另取一瓶100 mL胆盐乳糖培养基，加入1 mL铜绿假单胞菌菌液（50～100个/mL）作为铜绿假单胞菌阳性对照组。按铜绿假单胞菌检查法检验，结果见表4。

由表4可知，阴性菌对照组未检出铜绿假单胞菌，试验组检出铜绿假单胞菌。可采用常规法进行本品的铜绿假单胞菌检查。

2.5.4 大肠菌群检查法

分别取1∶10供试液1 mL，加入3管10 mL胆盐乳糖发酵管中，其中一管加入1 mL大肠埃希菌菌液（50～100个/mL）作为试验组，一管加入1 mL金黄色葡萄球菌菌液（50～100个/mL）作为阴性菌对照组；另取1管10 mL胆盐乳糖发酵管，加入1 mL大肠埃希菌菌液（50～100个/mL）作为大肠菌群阳性对照组。按大肠菌群检查法检验，结果见表5。

表4 铜绿假单胞菌检查结果

表5 大肠菌群检查结果

由表5可知，阴性菌对照组未检出大肠菌群，试验组检出大肠菌群。可采用常规法进行本品的大肠菌群检查。

2.5.5 沙门菌检查法

分别取本品10 g，加入3瓶200 mL营养肉汤中，其中一瓶加入1 mL沙门菌菌液（50～100个/mL）作为试验组，一瓶加入1 mL金黄色葡萄球菌菌液（50～100个/mL）作为阴性菌对照组；另取1瓶200 mL营养肉汤，加入1 mL沙门菌菌液（50～100个/mL）作为沙门菌阳性对照组，按沙门菌检查法检查。结果提示，阴性菌对照组未检出沙门菌，试验组未检出沙门菌，但沙门菌阳性对照组检出沙门菌，故不能采用常规法进行本品的沙门菌检查。所以沙门菌检查法调整为：分别取本品10 g，加入3瓶400 mL营养肉汤中，其中一瓶加入1 mL沙门菌菌液（50～100个/mL）作为试验组，一瓶加入1 mL金黄色葡萄球菌菌液（50～100个/mL）作为阴性菌对照组；另取1瓶400 mL营养肉汤，加入1 mL沙门菌菌液（50～100个/mL）作为沙门菌阳性对照组。按沙门菌检查法检验，结果见表6。

表6 沙门菌检查结果

由表6可知，阴性对照组未检出沙门菌，试验组检出沙门菌。可采用培养基稀释法进行本品的沙门菌检查。

3 讨论

本品按《中国药典》2010年版一部（附录ⅩⅢC）微生物限度检查法进行方法验证，结果表明，用pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制备样品，可采用培养基稀释法（1∶20供试液，0.1 mL/皿）进行细菌计数；采用培养基稀释法（400 mL营养肉汤）进行沙门菌检查；采用1∶10供试液的常规法进行霉菌及酵母菌计数和其他控制菌检查。笔者曾采用薄膜过滤法进行试验，但因供试品无法滤过，故选用培养基稀释法。

[1]国家药典委会.国家药品标准《新药转正标准》[M].11册.中国医药科技出版社，2011：43.

[2]徐愚聪，王野.熊胆粉的研究进展[J].华西药学杂志，2000，15（3）：200-202.

[3]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：附录 79.

[4]颜栋林，李萍，兰茜.柴黄片微生物限度检查法方法验证[J].中国当代医药，2009，16（16）：7.

[5]权明吉，金仁顺，朴龙，等.熊胆粉对二甲基亚硝胺诱发大鼠肝纤维化的抑制作用[J].世界华人消化杂志，2005，13（20）：88.

[6]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：化学工业出版社，2005：附录71.